Открытие первых низкомолекулярных ингибиторов белка Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) может обеспечить более точный контроль над редактированием генома на основе CRISPR-Cas9, сообщают исследователи 2 мая в журнале Cell.
Разработав набор высокопроизводительных биохимических и клеточных анализов, исследователи проверили разнообразную коллекцию малых молекул, чтобы идентифицировать соединения, которые нарушают связывание SpCas9 с ДНК и тем самым мешают его способности разрезать ДНК. Эти первые низкомолекулярные ингибиторы CRISPR-Cas9 легко проникают в клетки и имеют гораздо меньшие размеры, чем обнаруженные ранее белки против CRISPR. Новые соединения обеспечивают обратимый и дозозависимый контроль технологий на основе SpCas9, включая его применение для редактирования генов, базового редактирования и эпигенетического редактирования в клетках млекопитающих.
«Эти исследования закладывают основу для быстрой идентификации и использования низкомолекулярных ингибиторов как против SpCas9, так и против CRISPR-ассоциированных нуклеаз следующего поколения», - говорит старший автор Амит Чоудхари из Института Броуда Гарвардской медицинской школы и Бригам и женская больница. «Низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на CRISPR-ассоциированные нуклеазы, могут широко использоваться в фундаментальных, биомедицинских и оборонных исследованиях, а также в биотехнологических приложениях».
В настоящее время SpCas9 разрабатывается в качестве агента генной терапии для лечения множества состояний, включая ВИЧ, нарушения зрения, мышечную дистрофию и другие наследственные заболевания. Но эти терапевтические применения значительно выиграют от точного контроля дозы и времени активности SpCas9, чтобы уменьшить нецелевые эффекты. Контроль этих аспектов активности SpCas9 может также принести пользу другим приложениям, таким как эффективное редактирование ДНК модельных организмов для моделирования и изучения болезней, а также использование генных драйвов в генно-инженерных комарах для сдерживания распространения малярии и других заболеваний, переносимых комарами. болезни.
Потребность в дозированном и временном контроле SpCas9 создала спрос на молекулы анти-CRISPR. Хотя анти-CRISPR-белки, нацеленные на SpCas9, существуют, они имеют большие размеры и непроницаемы для клеток, необратимы в действии, могут быть расщеплены протеазами и могут представлять риск неблагоприятных иммунных реакций в организме. Напротив, низкомолекулярные ингибиторы протеолитически стабильны, обратимы и, как правило, неиммуногенны и могут легко доставляться в клетки посредством пассивной диффузии. Кроме того, их можно синтезировать в больших масштабах по низкой цене с небольшой изменчивостью от партии к партии.
В новом исследовании Чоудхари и его команда представили надежную, чувствительную и масштабируемую платформу для быстрой и экономичной идентификации и проверки низкомолекулярных ингибиторов SpCas9. Измерение активности CRISPR-Cas9 с высокой пропускной способностью, которое позволило бы проводить скрининг лекарств, было сложной задачей из-за свойств фермента SpCas9. В новой статье Чоудхари и его коллеги разработали высокопроизводительные первичные и вторичные анализы связывания SpCas9-ДНК и активности разрезания ДНК SpCas9 соответственно. Для первичного анализа они использовали биохимический метод, называемый поляризацией флуоресценции, для мониторинга взаимодействия между SpCas9 и меченым флуорофором сегментом ДНК, содержащим последовательности PAM. Во вторичном анализе они использовали автоматизированную микроскопию для измерения изменений флуоресценции, вызванных SpCas9-опосредованным расщеплением ДНК репортерного гена в клетках.
Используя эти тесты, исследователи сначала провели скрининг репрезентативных членов нескольких классов малых молекул, чтобы определить класс, члены которого часто ингибируют SpCas9. Команда идентифицировала два основных соединения, которые нарушают способность SpCas9 связывать ДНК и ингибируют опосредованное SpCas9 расщепление ДНК дозозависимым образом в клетках млекопитающих. Поскольку они блокируют связывание ДНК ферментом, эти молекулы также ингибируют каталитически нарушенные технологии SpCas9, в том числе для активации транскрипции, и стабильны в плазме человека..
«Эти результаты закладывают основу для точного химического контроля над активностью CRISPR-Cas9, что позволяет безопасно использовать такие технологии», - говорит Чоудхари. «Однако эти молекулы не готовы к применению на людях и не проверены на эффективность в организмах».
В будущих исследованиях исследователи планируют определить сайты связывания ингибиторов в комплексе SpCas9:гРНК, изучить механизм их действия и оптимизировать их активность. Они также определят, взаимодействуют ли молекулы с другими мишенями в клетках млекопитающих, и оценят их специфичность по отношению к другим нуклеазам, связанным с CRISPR. Ранние результаты, включенные в статью Cell, показывают, что молекулы достаточно специфичны для своей мишени, поскольку они не влияют на отдаленно родственный фермент CRISPR, Cas12a.