Гликаны необходимы практически для всех биологических процессов в организме. Эти сложные структуры, состоящие из взаимосвязанных молекул сахара, в нечетком изобилии украшают поверхности клеток. Гликаны являются важной частью идентичности клетки, помогая ей общаться с другими клетками и с внешней средой. Также известно, что гликаны играют жизненно важную роль в развитии рака, аутоиммунных заболеваний и бесчисленного множества других недугов.
Несмотря на их повсеместное распространение и важность, гликаны остаются одними из самых загадочных биологических игроков.
Теперь исследователи из Института биодизайна Аризонского государственного университета присоединились к международной исследовательской группе, чтобы исследовать более глубокие тайны структуры и функции гликанов. Для этого они собрали библиотеку ферментов, необходимых для создания, модификации и деградации гликанов. Используя эту библиотеку, группа смогла экспрессировать эти ферменты в двух типах клеток-хозяев - млекопитающих и насекомых.
«Очевидно, что эти сложные структуры сахара играют решающую роль как в здоровье, так и в заболевании», - говорит Джошуа ЛаБаер, директор Института биодизайна и Центра персонализированной диагностики Вирджинии Дж. Пайпер.
Он продолжает, что наука до сих пор очень плохо понимает активность гликанов, потому что, в отличие от других процессов в биологии, они не собираются на основе шаблона. Вместо этого они производятся в результате сложного взаимодействия большого семейства ферментов, которые добавляют и удаляют определенные сахара в зависимости от того, где встречаются разные члены семейства, и других факторов.«Впервые мы построили и собрали клонированные копии всех ферментов этого семейства, создав бесценный набор инструментов, который исследователи смогут использовать для создания и тестирования этих структур», - говорит Лабаер.
Результаты нового исследования, опубликованные в текущем выпуске журнала Nature Chem Bio, потенциально могут иметь широкое влияние в различных областях, от новой диагностики и терапии болезней до других достижений в области здравоохранения, материаловедения и энергетики.
Жизнь сладка
«Изучение гликановых структур в клеточных системах животных исторически было большой проблемой, особенно с точки зрения технологии», - говорит Келли Моремен из Университета Джорджии, ведущий автор нового исследования. «Чтобы понять, как эти молекулы производятся и регулируются с точки зрения функции на клеточной поверхности, важно понимать ферментативный механизм, который их производит, модифицирует и разрушает».
Один из четырех основных классов макромолекул, составляющих живые системы (наряду с нуклеиновыми кислотами, белками и липидами), гликаны необходимы для структуры и функционирования клеток. Они играют важную роль в передаче сигналов клетками, иммунитете и воспалении.
Например, гликаны на клеточных поверхностях имеют решающее значение для молекулярного распознавания, направляя лейкоциты по телу к местам инфекции, позволяя иммунной системе реагировать там, где это необходимо. Эта динамика четко прослеживается на ранних стадиях инфекции гриппа, когда частица вируса гриппа прикрепляется к клетке-хозяину человека, распознавая и связываясь с гликанами клеточной поверхности.
Иммунная система реагирует на такие угрозы, обучаясь распознавать гликановое сахарное покрытие вирусов, бактерий и других захватчиков, запуская как врожденные, так и адаптивные защитные механизмы.
Различные формы сахара необходимы для жизни. Глюкоза, одна из самых важных, является основным метаболитом, обеспечивающим энергию для мозга. Это также иллюстрирует двойственную природу сложных сахаров, поскольку их нарушение регуляции является основным фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Диабет, например, возникает в результате неправильного контроля уровня глюкозы нормальными метаболическими механизмами. Высокие концентрации глюкозы могут вызвать серьезное повреждение органов, а низкие концентрации могут привести к потере сознания и внезапной смерти из-за недостаточного количества энергии.
В других местах стенки растительных клеток в основном состоят из гликанов и составляют основной источник биологического связывания углерода на планете, или биомассы. Они представляют собой в значительной степени неиспользованный устойчивый источник энергии, основанной на неископаемом топливе.
До сих пор гликаны не пользовались таким же уровнем научного внимания, как нуклеиновые кислоты или белки, и многое в их тонком спектре функций остается окутанным тайной. Причина в том, что головокружительный набор гликановых структур до недавнего времени было чрезвычайно трудно изучать.
От генов к белкам
Большая часть механизма жизни хорошо изучена, по крайней мере, в общих чертах. Различное расположение 4 нуклеиновых кислот в ДНК образует гены, которые сначала транскрибируются в РНК, а затем транслируются в белки в соответствии со строгим режимом.
Гликаны бывают разные. Они не производятся из шаблонов, таких как РНК и белок, а вместо этого собираются на лету по мере необходимости в соответствии со сложными факторами окружающей среды, включая клеточный метаболизм, тип клеток, стадию развития, доступность питательных веществ и многие другие сигналы. Специализированные клетки, такие как нервные, кожные или мышечные клетки, имеют свой собственный уникальный набор гликанов, а больные клетки обычно демонстрируют характерные аномалии в украшающих их гликанах. Чтобы воспроизвести это богатство разнообразия гликанов, задействуется большое количество специализированных ферментов.
Гликаны обычно прикрепляются к определенным участкам белков, модулируя их биологическую активность посредством молекулярного распознавания или влияя на время их циркуляции в кровотоке. Гликозилирование - присоединение молекул гликанов - является одним из важнейших регуляторных механизмов, влияющих на белки после того, как они уже были транслированы с РНК. Такие посттрансляционные модификации позволяют довольно скромному количеству человеческих генов - всего 25 000 или около того - генерировать поразительную сложность и разнообразие, наблюдаемые у людей и среди человеческих популяций.
Это новое понимание белков как высокодинамичных объектов произвело революцию в современной биологии, хотя и значительно усугубило сложности, с которыми сталкиваются исследователи. Аккуратная модель 1 гена, генерирующего 1 последовательность РНК, дающая единый белок с известной структурой и функцией, уступила место миру тонких и динамичных модификаций белков, имеющих глубокие последствия для здоровья и болезней человека. Изучение аберрантно сформированных gycans, например, теперь является важным новым направлением исследования рака.
Дизайн с сахаром
Но как образуются гликаны? Процесс начинается, когда потребляются простые сахара в пищевых продуктах, известные как моносахариды. Эти моносахариды перемещаются в два ключевых субклеточных компартмента, известных как комплекс Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Эти связанные с мембраной органеллы действуют как фабрики по ступенчатой сборке строительных блоков моносахаридов в сложные разветвленные гликановые структуры.
Гликаны затем прикрепляются к белкам или липидам и доставляются к плазматической мембране, покрывая поверхности клеток этими молекулами сахара. Было подсчитано, что 70 процентов белков клеточной поверхности гликозилированы, и исследователи все еще пытаются установить функцию всех этих гликозилирований.
Применения таких исследований могут включать методы на основе гликанов для раннего выявления рака и других заболеваний, а также разработку будущих вакцин и фармацевтических препаратов против инфекционных заболеваний на основе лучшего понимания взаимодействия хозяина и патогена и иммунного ответа. Создание новых продуктов или видов топлива, состоящих из углеводного сырья, также может быть связано с достижениями в области гликобиологии.
Доступ к библиотеке
В текущем исследовании исследователи успешно произвели полный спектр гликанобразующих и модифицирующих ферментов, ответственных за производство более 7000 гликановых структур позвоночных. Чтобы достичь этого, в исследовании была предпринята попытка упростить процесс, получив упрощенные версии ферментов, способные эффективно экспрессироваться в клетках-хозяевах.
«С помощью Джейсона (Стил) и Джоша (ЛаБаер) мы разработали стратегию проектирования, чтобы захватить эти кодирующие области и поместить их в удерживающий вектор», - говорит Мормен. «Затем мы смогли поместить их в клетки насекомых или млекопитающих и проверить их способность экспрессироваться в этих системах».
Это важное достижение. Предыдущие попытки производить и экспрессировать гликоферменты в более простых бактериальных клетках, таких как E. coli, в значительной степени провалились. Чтобы управлять подвигом в более сложных эукариотических клетках, таких как клетки насекомых и млекопитающих, требовалась значительная модификация генов, кодирующих ферменты, перед их встраиванием в специализированные векторы, известные как кассеты. Затем эти кассеты, кодирующие гликоферменты, встраивали в клетки насекомых и млекопитающих, где они экспрессировались.
Группа составила исчерпывающий список из 339 гликоферментов, ответственных за образование, модификацию и деградацию гликанов, нацеленных на экспрессию белков. Хотя результаты показали успешную экспрессию гликоферментов на высоком уровне как в клетках насекомых, так и в клетках млекопитающих, авторы отмечают явные различия в конкретных уровнях экспрессии в каждой из двух модельных систем.
Полученная обширная библиотека гликоферментов обеспечивает жизненно важный ресурс для будущих достижений в области гликобиологии и доступна исследователям во всем мире через DNASU.
Углубленное понимание структуры и функции гликанов, изученное с помощью новой библиотеки ферментов, поможет продвинуть ряд интересных областей исследований, включая геномику, протеомику, химический синтез, материаловедение и инженерию.