Пока мир ждет вакцин, чтобы взять под контроль пандемию COVID-19, ученые Калифорнийского университета в Сан-Франциско разработали новый подход к сдерживанию распространения SARS-CoV-2, вируса, вызывающего заболевание.
Во главе с аспирантом Калифорнийского университета в Сан-Франциско Майклом Шуфом группа исследователей разработала полностью синтетическую, готовую к производству молекулу, которая ограничивает ключевой механизм SARS-CoV-2, позволяющий вирусу заражать наши клетки. Как сообщается в новой статье, которая теперь доступна на сервере препринтов bioRxiv, эксперименты с использованием живого вируса показывают, что эта молекула является одним из самых мощных противовирусных средств против SARS-CoV-2, которые когда-либо были обнаружены.
В тестируемом аэрозольном препарате, названном исследователями «AeroNabs», эти молекулы можно было вводить самостоятельно с помощью назального спрея или ингалятора. Используемые один раз в день, AeroNab могут обеспечить мощную и надежную защиту от SARS-CoV-2 до тех пор, пока не появится вакцина. Исследовательская группа ведет активные переговоры с коммерческими партнерами по увеличению производства и клинических испытаний AeroNabs. Если эти тесты пройдут успешно, ученые стремятся сделать AeroNab широко доступным в качестве недорогого безрецептурного лекарства для профилактики и лечения COVID-19.
«Аэронабс гораздо более эффективен, чем носимые формы средств индивидуальной защиты, мы думаем о AeroNabs как о молекулярной форме СИЗ, которая может служить важной временной мерой до тех пор, пока вакцины не обеспечат более постоянное решение для COVID-19», - сказал представитель AeroNabs co. -изобретатель Питер Уолтер, доктор философии, профессор биохимии и биофизики в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. Уолтер добавил, что для тех, кто не может получить доступ к вакцинам против SARS-CoV-2 или не реагирует на них, AeroNabs может стать более постоянной линией защиты от COVID-19.
«Мы собрали невероятную группу талантливых биохимиков, клеточных биологов, вирусологов и структурных биологов, чтобы завершить проект от начала до конца всего за несколько месяцев», - сказал Шоф, сотрудник лаборатории Уолтера и соучредитель AeroNabs. -изобретатель.
Дизайн в стиле ламы
Несмотря на то, что AeroNab были разработаны полностью в лаборатории, они были вдохновлены нанотелами, антителоподобными иммунными белками, которые естественным образом встречаются у лам, верблюдов и родственных им животных. С момента их открытия в бельгийской лаборатории в конце 1980-х отличительные свойства нанотел заинтриговали ученых всего мира.
«Хотя они функционируют так же, как антитела, обнаруженные в иммунной системе человека, нанотела предлагают ряд уникальных преимуществ для эффективной терапии против SARS-CoV-2», - объяснил соавтор изобретения Аашиш Манглик, доктор медицинских наук, доцент кафедры фармацевтической химии, который часто использует нанотела в качестве инструмента в своих исследованиях структуры и функций белков, которые посылают и получают сигналы через клеточную мембрану.
Например, нанотела на порядок меньше человеческих антител, что облегчает манипулирование ими и их модификацию в лаборатории. Их небольшой размер и относительно простая структура также делают их значительно более стабильными, чем антитела других млекопитающих. Кроме того, в отличие от человеческих антител, нанотела можно легко и недорого производить в массовом порядке: ученые вставляют гены, содержащие молекулярные чертежи для создания нанотел, в кишечную палочку или дрожжи и превращают эти микробы в высокопроизводительные фабрики нанотел. Тот же метод десятилетиями безопасно использовался для массового производства инсулина.
Но, как заметил Манглик, «нанотела были для нас лишь отправной точкой. Хотя сами по себе они привлекательны, мы думали, что сможем улучшить их с помощью белковой инженерии. В конечном итоге это привело к разработке AeroNabs».
Спайк - ключ к заражению
SARS-CoV-2 полагается на свои так называемые шиповидные белки для заражения клеток. Эти шипы усеивают поверхность вируса и придают вид короны при просмотре в электронный микроскоп - отсюда и название «коронавирус» для семейства вирусов, которое включает SARS-CoV-2. Однако шипы - это больше, чем просто украшение - они являются важным ключом, который позволяет вирусу проникать в наши клетки.
Как и выдвижной инструмент, шипы могут переключаться из закрытого, неактивного состояния в открытое, активное состояние. Когда какой-либо из примерно 25 шипов вирусной частицы становится активным, три «рецептор-связывающих домена» этого шипа или RBD становятся открытыми и праймируются для присоединения к ACE2 (произносится как «ace two»), рецептору, обнаруженному в клетках человека этой линии. легкие и дыхательные пути.
Благодаря взаимодействию типа «замок-ключ» между рецептором ACE2 и шипом RBD вирус проникает в клетку, где затем превращает своего нового хозяина в производителя коронавируса. Исследователи полагали, что если им удастся найти нанотела, препятствующие взаимодействию шипа и ACE2, они смогут предотвратить заражение клеток вирусом.
Нанотела отключают спайки и предотвращают заражение
Чтобы найти эффективных кандидатов, ученые проанализировали недавно разработанную библиотеку в лаборатории Манглика из более чем 2 миллиардов синтетических нанотел. После последовательных раундов тестирования, в ходе которых они вводили все более строгие критерии для исключения слабых или неэффективных кандидатов, ученые получили 21 нанотело, которое предотвратило взаимодействие модифицированной формы шипа с ACE2.
Дальнейшие эксперименты, включая использование криоэлектронной микроскопии для визуализации интерфейса нанотело-шип, показали, что наиболее мощные нанотела блокируют взаимодействие шип-ACE2, прочно прикрепляясь непосредственно к RBD шипа. Эти нанотела действуют как оболочка, которая покрывает «ключ» RBD и предотвращает его вставку в «замок» ACE2.
Имея в руках эти результаты, исследователям все еще нужно было продемонстрировать, что эти нанотела могут предотвратить заражение клеток настоящим вирусом. Вероника Резель, доктор философии, вирусолог в лаборатории Марко Виньуцци, доктора философии, в Институте Пастера в Париже, протестировала три наиболее многообещающих нанотела против живого SARS-CoV-2 и обнаружила, что нанотела чрезвычайно эффективны, предотвращая инфекцию даже при чрезвычайно высоких температурах. низкие дозы.
Наиболее мощное из этих нанотел, однако, действует не только как оболочка над RBD, но и как молекулярная мышеловка, зажимая шип в его закрытом, неактивном состоянии, что добавляет дополнительный уровень защиты от взаимодействия шип-ACE2, которые приводят к инфекции.
От нанотел к AeroNabs
Затем ученые разработали это нанотело двойного действия несколькими способами, чтобы превратить его в еще более мощное противовирусное средство. В одной серии экспериментов они мутировали каждый из аминокислотных строительных блоков нанотела, контактирующего с шипом, и обнаружили два специфических изменения, которые привели к 500-кратному увеличению эффективности.
В ходе отдельной серии экспериментов они разработали молекулярную цепь, которая могла связать вместе три нанотела. Как уже отмечалось, каждый шиповидный белок имеет три RBD, любой из которых может присоединяться к ACE2, обеспечивая проникновение вируса в клетку. Связанное тройное нанотело, разработанное исследователями, гарантировало, что если одно нанотело прикрепится к RBD, два других прикрепятся к оставшимся RBD. Они обнаружили, что это тройное нанотело в 200 000 раз мощнее, чем одно нанотело по отдельности.
И когда они воспользовались результатами обеих модификаций, связав вместе три мощных мутировавших нанотела, результаты были «зашкаливающими», сказал Уолтер. «Он был настолько эффективен, что превзошел наши возможности измерить его эффективность».
Легко вводить в виде аэрозоля
Эта сверхмощная трехкомпонентная конструкция нанотела легла в основу AeroNabs.
В заключительной серии экспериментов исследователи подвергли трехкомпонентные нанотела серии стресс-тестов, подвергая их воздействию высоких температур, превращая в порошок длительного хранения и изготавливая аэрозоль. Каждый из этих процессов сильно повреждает большинство белков, но ученые подтвердили, что благодаря присущей нанотелам стабильности противовирусная активность в аэрозольной форме не снижается, что позволяет предположить, что AeroNabs является мощным противовирусным средством против SARS-CoV-2, которое целесообразно вводить через ингалятор длительного хранения или назальный спрей.
«Мы не одиноки в том, что AeroNab - замечательная технология, - сказал Манглик. «Наша команда ведет постоянные переговоры с потенциальными коммерческими партнерами, которые заинтересованы в производстве и распространении AeroNab, и мы надеемся вскоре начать испытания на людях. Если AeroNab окажутся столь же эффективными, как мы ожидаем, они могут помочь изменить ход пандемии во всем мире».
Авторы: Дополнительные авторы включают Брайана Фауста, Рубена А. Сондерса, Смрити Сангван, Ника Хоппе, Морган Бун, Кристиана Баче Биллесбёлле, Марселла Зиманьи, Ишана Дешпанде, Цзяхао Лян, Адитья А. Ананд, Нив Добзински, Бет Шошана Жа, Бенджамин Барси-Райн, Владислав Белый, Силке Нок и Ювей Лю из UCSF; Камилла Р. Симоно, Кристоффер Леон, Неван Дж. Кроган, Даниэль Л. Суони и Мелани Отт из Института количественных биологических наук (QBI) Калифорнийского университета в Сан-Франциско и Института Дж. Дэвида Гладстона; Эндрю В. Бэриле-Хилл из Cytiva Life Sciences; Саян Гупта и Кори И. Ралстон из Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли; Крис М. Уайт и Адольфо Гарсия-Састре из Медицинской школы Икана на горе Синай; и Консорциум структурной биологии QBI Coronavirus Research Group. Шуф, Фауст, Сондерс, Сангван и Резель являются соавторами рукописи.
Финансирование: Эта работа была поддержана Фондом реагирования на COVID-19 UCSF, грантом от Allen & Company, и сторонниками Программы прорывных биомедицинских исследований UCSF (PBBR), который был создан при поддержке Фонда Сандлера. Другая поддержка включала гранты Национального института здравоохранения (NIH) DP5OD023048, S10OD020054, S10OD021741, 1R01GM126218; Грант Laboratoire d'Excellence ANR-10-LABX-62-IBEID; кампания по сбору средств Института Пастера «СРОЧНО COVID-19»; Управление науки и Управление биологических и экологических исследований Университета США. S. Министерство энергетики по контракту DE-AC02-05CH11231; постдокторская стипендия Хелен Хэй Уитни; Фонд Альфреда Бензона; подарок от Фонда Родденберри; Медицинский институт Говарда Хьюза; Благотворительные фонды Пью; Фонд Эстер А. и Джозефа Клингенштейна; и Программа Searle Scholars Program.
Раскрытие информации: Шуф, Фауст, Сондерс, Хоппе, Уолтер и Манглик являются изобретателями предварительного патента, описывающего анти-спайковые нанотела, описанные в рукописи.