CRISPR/Cas9 теперь является нарицательным, связанным с генно-инженерными исследованиями. Благодаря передовым исследованиям, описанным в их статье, опубликованной в Scientific Reports, группа исследователей из Токийского университета науки, Университета Мэйдзи и Токийского университета сельского хозяйства и технологий под руководством доктора Такаюки Аразоэ и профессора Сигеру Кувата недавно создала серию новых стратегий повышения эффективности целенаправленного разрушения генов и «введения» новых генов с использованием системы CRISPR/Cas9 в пирикуляриоз рисового пирикуляриоза (Magnaporthe) oryzae. Эти стратегии включают более быстрое (одноэтапное) введение гена, использование небольших гомологичных последовательностей и обход определенных предварительных «паттернов» ДНК хозяина и модификацию компонентов хозяина.
Команда под руководством доктора Аразоэ и профессора Куваты разработала простые и быстрые методы редактирования генов (разрушение целевых генов, замена последовательности и повторное введение нужных генов) с использованием CRISPR/Cas9 в пирикулярии рисового пирикуляриоза. Magnaporte) oryzae, разновидность мицелиального гриба. Вдохновленные обнадеживающими результатами, исследователи предполагают: «Растения и их патогены все еще находятся в процессе совместной эволюции в природе. Использование механизмов мутации модельных патогенных грибов в качестве метода редактирования генома может привести к развитию новых новых методов генной инженерии».
Рабочий компонент системы CRISPR/Cas9 связывается с целевым участком гена (ДНК) и вызывает сайт-специфический двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК. Для эффективного связывания этого компонента требуется определенный «мотив» или «паттерн», называемый смежным с протоспейсером мотивом (PAM), который следует за областью целевого гена.
Большинство методов редактирования генома требуют индуцирования DSB в целевом сайте, которые запускают пути «ремонта» ДНК в хозяине. Гомологическая рекомбинация (HR) представляет собой механизм репарации DSB, и он полезен, поскольку добавляет комплементарные последовательности. Однако лежащая в основе методология трудоемка, и ее эффективность обычно зависит от внешних факторов, таких как свойства хоста, а также PAM. HR можно разделить на два пути: «некроссоверный» (генная конверсия) и «кроссоверный» тип. Известно, что репарация перекрестного типа происходит в клетках, которые подвергаются мейозу. Однако понимание их роли в клетках, подвергающихся митозу, ограничено, а о мицелиальных грибах такая информация практически отсутствует. Именно этот пробел в знаниях и пытались устранить исследователи.
В своем исследовании исследователи сначала создали вектор (систему доставки генов) на основе CRISPR/Cas9, чтобы подтвердить HR перекрестного типа в области гена-реципиента в пирикуляриозе риса.
Затем, чтобы проверить нацеливание генов или «замену последовательности», они создали «мутантный» вектор, оптимизированный для HR одиночного перекрестного типа, для целенаправленного разрушения гена-хозяина, который кодирует сциталондегидратазу (SDH), белок участвует в образовании меланина. Этот вектор был введен в вектор, содержащий ген фосфотрансферазы гигромицина B (hph), который придает устойчивость к антибиотику гигромицину B. Исследователи предположили, что HR с одним перекрестным типом вставит весь вектор вместе с hph в целевой сайт. Мутанты с нарушенным геном SDH будут идентифицированы как белые колонии (из-за потери меланина) на среде, содержащей гигромицин B. Исследователи обнаружили, что количество устойчивых к гигромицину B белых колоний резко увеличилось при использовании вектора CRISPR/Cas9, который означает, что система CRISPR/Cas9 эффективна в индукции HR одиночного перекрестного типа. Наибольшее преимущество этого метода заключается в том, что для него требуются чрезвычайно короткие гомологичные последовательности (100 пар оснований, что очень мало в молекулярной биологии).
Исследователи также использовали аналогичную стратегию, чтобы проверить, возможно ли введение гена (или «включение») с помощью одиночного перекрестного типа HR с использованием вектора CRISPR/Cas9. Они использовали ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который широко используется в качестве «репортерного» гена, заставляющего клетки-хозяева светиться флуоресцентно-зеленым цветом при вставке в их геном. Они предположили, что один перекрестный HR приведет к введению GFP в реципиентную последовательность. Действительно, они обнаружили, что использование вектора CRISPR/Cas9 приводит к образованию зеленых флуоресцентных колоний на среде с гигромицином. Эти результаты показывают, что систему CRISPR/Cas9 можно использовать для эффективного «одноэтапного» нокаута генов.
Это исследование указывает на удивительный факт, что, возможно, PAM не так уж необходимы для редактирования генов CRISPR/Cas9 у грибов. Приветствуя успех исследования, команда заявляет: «Мы обнаружили, что мицелиальные грибы обладают уникальными геномными характеристиками, в которых кроссоверы часто индуцируются даже в соматических клетках путем расщепления ДНК-мишени. Мы использовали эти характеристики, чтобы разрушить ДНК-мишень и ввести «репортерные» гены. Нам также удалось повысить эффективность и скорость врезки, используя одностадийный процесс. Эта технология преодолевает ограничение, налагаемое PAM, которое является одним из самых больших недостатков системы CRISPR/Cas9, и обеспечивает более гибкое редактирование генома, что было затруднительно в предыдущих исследованиях мицелиальных грибов».
Наконец, отвечая на вопрос о более широком применении этого исследования, д-р Аразоэ и профессор Кувата красноречиво заявляют: «Гриб пирикуляриоза риса является важным патогеном, вызывающим разрушительное заболевание риса, который является основным продуктом питания страны. Метод редактирования генома на основе CRISPR/Cas9, разработанный в нашем исследовании, может ускорить молекулярно-биологические исследования этого патогена, в конечном итоге способствуя стабильному снабжению продовольствием и безопасности пищевых продуктов на растительной основе. Также этот метод применим к другим нитчатым грибам, широко используемым в промышленности - особенно в биоперерабатывающей, пищевой и ферментационной промышленности."