Биомедицинские инженеры из Университета Дьюка использовали метод генной инженерии CRISPR/Cas9, чтобы отключить ген, регулирующий уровень холестерина у взрослых мышей, что привело к снижению уровня холестерина в крови и репрессии генов, продолжающейся в течение шести месяцев после однократного лечения.
Это первый случай, когда исследователи доставили репрессоры CRISPR/Cas9 для целенаправленного терапевтического подавления генов на моделях взрослых животных. Исследование появилось в сети в Nature Communications 26 апреля.
Система CRISPR/Cas9 основана на противовирусном защитном механизме бактерий, в котором фермент Cas9 распознает последовательности вирусной ДНК предыдущих инфекций и разрезает вторгшуюся ДНК во время повторного заражения. Исследователи разработали систему CRISPR/Cas9 не только для обнаружения и вырезания определенных последовательностей ДНК, но и для включения или выключения экспрессии целевых генов без внесения необратимых изменений в кодирующую последовательность ДНК.
Хотя этот метод репрессора CRISPR/Cas9 стал надежным инструментом для нарушения регуляции генов в моделях клеточных культур, он еще не был адаптирован для доставки взрослым животным для таких приложений, как генная терапия.
В своем последнем исследовании Чарльз Герсбах, адъюнкт-профессор биомедицинской инженерии семьи Руни в Университете Дьюка, и сотрудники его лаборатории разработали подход к эффективной упаковке и доставке репрессорной системы CRISPR/Cas9 мышам. Они проверили свою систему доставки, отключив Pcsk9, ген, который регулирует уровень холестерина. Хотя было разработано несколько лекарств для лечения высокого уровня холестерина и сердечно-сосудистых заболеваний путем блокирования активности Pcsk9, этот новый подход предотвратит создание Pcsk9..
«Ранее мы использовали такие же инструменты для включения и выключения генов в культивируемых клетках, и мы хотели посмотреть, сможем ли мы также доставить их в модели животных с подходом, который подходит для генной терапии», - Герсбах. сказал. «Мы хотели изменить гены таким образом, чтобы это имело терапевтический эффект, и Pcsk9 является полезным доказательством концепции, учитывая его роль в регулировании уровня холестерина, который, в свою очередь, влияет на такие проблемы со здоровьем, как болезни сердца».
Чтобы протестировать целевой репрессор Pcsk9 на взрослом животном, команда решила использовать векторы аденоассоциированных вирусов (AAV) - небольшие вирусы, которые были созданы для нацеливания на различные типы тканей в клинических испытаниях генной терапии человека. Из-за небольшого предела количества груза у вектора команда не могла использовать обычный фермент Cas9 из Streptococcus pyogenes. Вместо этого они решили использовать Cas9 меньшего размера из Staphylococcus aureus. Они также деактивировали функцию разрезания ДНК Cas9, создав «мертвую» версию фермента dCas9, который связывается с целевой последовательностью ДНК, но не разрезает ее.
dCas9 можно комбинировать с белком KRAB, который подавляет экспрессию генов, создавая репрессор CRISPR/Cas9, который блокирует транскрипцию, снижает доступность хроматина и подавляет экспрессию генов без изменения базовой последовательности ДНК. Используя аденовирусный вектор для доставки репрессоров на основе CRISPR/Cas9 в печень мышей, исследователи снизили уровни Pcsk9 и холестерина у обработанных мышей.
Хотя эксперимент был успешным, исследователи также наблюдали выброс ферментов печени в кровь только при лечении, которое включало Cas9. Хотя эти уровни ферментов печени оставались ниже критического порога и со временем нормализовались, их повышенные уровни указывали на то, что терапия потенциально вызывала иммунные ответы в печени, где накапливаются вирус и фермент Cas9. Это поднимает вопросы об эффективности множественных инъекций.
«Одна из интересных вещей, которые мы обнаружили, выглядела как иммунный ответ против белка Cas9», - говорит Пратикша Такоре, аспирант, руководившая работой в лаборатории Герсбаха. «После инъекции мы увидели, что уровни нашего целевого гена, Pcsk9, снизились, но мы также наблюдали увеличение экспрессии многих генов иммунных клеток, что указывает на то, что иммунные клетки инфильтрировали печень после того, как мы доставили Cas9 мышам. лучшее понимание этого иммунного ответа и того, как его модулировать, будет важно для использования технологий Cas9 в терапии».
По мере того как исследователи разрабатывают новые способы использования CRISPR/Cas9 для терапии и исследований, появляется все больше информации о том, как иммунная система живых организмов реагирует на доставку системы CRISPR/Cas9. Поскольку фермент Cas9 получен из бактерий, иммунная система может распознать его как чужеродный белок из вторгшегося организма и вызвать ответную реакцию. Также есть опасения, что потенциальные пациенты для терапии на основе CRISPR/Cas9 уже могут быть подготовлены к выработке иммунных ответов против этих систем, потому что ферменты Cas9, наиболее часто используемые в исследованиях, получают из обычных бактерий, воздействию которых люди регулярно подвергаются.
«В этой области только начинают изучать этот вопрос, и становится ясно, что иммунный ответ является важной проблемой», - сказал Герсбах. «Хотя мы наблюдали иммунный ответ у мышей, когда вводили Cas9, уровни ферментов печени в сыворотке, по-видимому, со временем снижались без какого-либо вмешательства, а эффект подавления Pcsk9 сохранялся, несмотря ни на что».
Продолжая исследования, Герсбах и его сотрудники надеются собрать больше информации, чтобы лучше понять иммунный ответ против Cas9 и стабильность эпигенетической модуляции.
«При таком подходе нам еще многое предстоит изучить», - сказал Такоре. «Инструменты CRISPR/Cas9 так хорошо зарекомендовали себя в моделях клеточных культур, что интересно применять их в большей степени в естественных условиях, особенно когда мы изучаем важные терапевтические мишени и используем средства доставки, которые могут иметь отношение к лечению заболеваний человека."