В статье, опубликованной сегодня в журнале Science, исследователи из Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда сообщают о новом инструменте, который разрабатывает диагностический SHERLOCK на основе CRISPR для быстрого реагирования на вспышки. Обновления SHERLOCK, впервые представленные в 2017 году, позволяют клиницистам быстро и недорого диагностировать образцы пациентов и отслеживать эпидемии, такие как лихорадка Эбола и Зика, с помощью ограниченного оборудования, устраняя препятствия для быстрого развертывания в зонах вспышки.
Платформа теперь может использоваться для обнаружения вирусов непосредственно в клинических образцах, таких как кровь или слюна, исключая этап обработки, который ранее требовал лабораторной среды и профессионально обученного персонала. Эта разработка позволяет использовать SHERLOCK в областях, где доступ к специальному обучению и клиническим лабораториям может быть затруднен.
Команда также упростила возможности SHERLOCK отличать родственные виды вирусов друг от друга и продемонстрировала способность платформы выявлять клинически значимые мутации, такие как небольшая мутация вируса Зика, связанная с микроцефалией.
«Быстрые и чувствительные инструменты имеют решающее значение для диагностики, наблюдения и характеристики инфекции», - говорит старший автор Пардис Сабети, член института Броуда, профессор Гарвардского университета и медицинский исследователь Говарда Хьюза. «Мы взяли технологию SHERLOCK и оптимизировали ее в контексте этих очень прикладных биологических сценариев."
Команда Сабети продолжает работу над возможностью тестирования SHERLOCK с сотрудниками в Нигерии, которая этой весной пережила необычный всплеск случаев лихорадки Ласса. Лихорадка Ласса часто вызывает симптомы, характерные для многих вирусов, и основное лечение работает лучше всего, если его назначить на ранней стадии, поэтому точный и быстрый диагноз имеет решающее значение.
Диагностическая платформа SHERLOCK (сокращение от «Разблокировка специфического высокочувствительного ферментативного репортера») использует запрограммированный фермент Cas13 в паре с репортерными молекулами для индикации присутствия генетической мишени, такой как вирус. До сих пор важным предварительным этапом для SHERLOCK было извлечение и выделение нуклеиновых кислот из образцов пациентов, для чего обычно требуется лаборатория и обученный персонал, что затрудняет его выполнение в полевых условиях. Исследовательская группа под руководством аспиранта Гарварда Кэтрин Фрейе и доктора наук Кэмерона Мирволда из лаборатории Сабети разработала более простой метод, который позволяет Cas13 обнаруживать свою цель непосредственно в образцах телесных жидкостей, таких как слюна или кровь.
Процесс называется HUDSON, или нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз. Он состоит из быстрой химической и термической обработки образцов, чтобы инактивировать определенные ферменты, которые в противном случае разрушали бы генетические мишени. Затем обработанные клинические образцы можно подвергнуть процедуре SHERLOCK, а окончательные результаты обнаружения, положительные или отрицательные, можно легко просмотреть на бумажных полосках, которые исследователи Института Броуда представили в серии обновлений SHERLOCK, опубликованных в феврале. Весь конвейер может быть завершен менее чем за два часа.
«Эта система еще больше приближает нас к быстрой и удобной диагностике, которую можно легко развернуть где угодно», - говорит Сабети.
«С каждым усовершенствованием конвейера SHERLOCK процесс диагностики ускоряется и требует меньше оборудования», - добавляет Фрейе. «Мы пытаемся сделать эти инструменты лучше и проще в использовании, чтобы диагностика могла быть ближе к пациенту, где это действительно необходимо."
Объединив HUDSON и SHERLOCK, команда смогла обнаружить вирус Денге непосредственно в образцах слюны и сыворотки крови пациентов. Платформа также может обнаруживать частицы вируса Зика, которые были добавлены в образцы крови и мочи здоровых людей.
Кроме того, команда разработала реагенты SHERLOCK, которые позволяют еще проще и быстрее отличать несколько родственных видов вирусов (Зика, лихорадка денге, лихорадка Западного Нила и желтая лихорадка) друг от друга. Эти улучшения особенно полезны, когда у пациента есть общие симптомы, такие как лихорадка, которые могут быть вызваны более чем одним вирусом.
«В таких местах, как Южная Америка, многие похожие вирусы циркулируют совместно, и наличие диагностики, которая может быстро определить разницу, имеет решающее значение», - говорит Фрейе. «С помощью этого нового анализа пациент может сдать один образец крови или мочи, его можно проанализировать всего за несколько реакций, чтобы определить, какой вирус он содержит, а затем этот пациент может начать правильное лечение."
Команда также продемонстрировала острую чувствительность SHERLOCK к мутациям, которые происходят всего в одном нуклеотиде, например, к мутациям, которые могут придать вирусу устойчивость к лекарственным препаратам или большую инфекционность. В текущей статье исследователи разработали тесты, которые могли бы обнаружить мутацию вируса Зика, связанную с микроцефалией.
«Примерно через неделю после того, как эта конкретная мутация была описана в литературе, у нас была готовая диагностика, и мы смогли обнаружить ее в образцах пациентов, собранных во время недавней вспышки вируса Зика», - вспоминает Мирволд. «Это действительно видение - иметь возможность рассказать кому-то не только о том, какой у него вирус, но и о характеристиках этого конкретного штамма и о том, откуда он мог появиться».
Чтобы обеспечить широкую доступность SHERLOCK во время вспышек, компания Broad разрабатывает структуру, обеспечивающую легкий доступ к диагностической платформе SHERLOCK в развивающихся странах, где потребность в быстрой, недорогой, надежной полевой диагностике является насущной. самое срочное.