Исследователи из Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) в Мюнхене использовали специальную технику визуализации на основе флуоресценции для отслеживания изменений формы, происходящих, когда поровые белки клеточной мембраны экспортируют молекулы во внеклеточную среду.
Биологическую клетку можно представить себе как улей, в котором белки играют роль рабочих пчел. Однако белки гораздо более универсальны и могут взаимодействовать друг с другом, образуя молекулярные машины. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе их функциональной универсальности, структурные биологи в первую очередь полагались на анализ их трехмерных структур после кристаллизации. Однако белковые кристаллы дают практически статичную картину. «Таким образом, этот подход сам по себе недостаточен», - говорит Торбен Кордес, профессор физической и синтетической биологии в LMU. «Нам необходимо понять молекулярные движения и структурные изменения, которые происходят в белках в ходе их работы». Кордес и его исследовательская группа сосредоточились на поиске способов визуализации динамики белков. В сотрудничестве с группами из Имперского колледжа Лондона и Университета Гронингена им удалось охарактеризовать конформационные изменения, происходящие в классе интегрированных в мембрану транспортных белков. Новые данные опубликованы в журнале EMBO.
Исследователи сосредоточились на так называемых переносчиках ABC, важных мембранных белках, которые участвуют во множестве клеточных процессов, включая поглощение питательных веществ, детоксикацию и иммунные реакции. Все транспортеры ABC состоят из двух модулей. Трансмембранный домен, встроенный в мембрану, образует пору, через которую субстрат экспортируется из клетки. Внутриклеточный домен, связывающий нуклеотиды, отвечает за поставку необходимой энергии, что он делает путем связывания и расщепления АТФ, основного переносчика химической энергии в клетке.
Чтобы определить, как транспортеры ABC на самом деле переправляют свои субстраты через мембрану, Кордес и его коллеги использовали недавно стандартизированный метод, называемый одномолекулярным FRET. Этот метод основан на том факте, что при химическом присоединении различных флуоресцентных красителей к взаимодействующим молекулам или доменам сигнал флуоресценции изменяется в зависимости от расстояния между ними (из-за «резонансного переноса энергии флуоресценции»). Эти изменения можно измерить с помощью чувствительного микроскопа, позволяющего отслеживать как изменения конформационной структуры, так и связывающие взаимодействия между различными белковыми субъединицами. «Таким образом мы смогли показать, что транспорт субстрата через мембрану требует серьезных изменений в конформации белка ABC», - говорит Кордес. Оба модуля транспортера могут существовать как в открытой, так и в закрытой конформации. В начале операционного цикла нуклеотидсвязывающий домен открыт внутрь. Затем связывание молекулы АТФ вызывает закрытие этого модуля. Если - и только если - субстрат уже находится в поре, образованной трансмембранным доменом, трансмембранный домен принимает открытую конформацию, высвобождая субстрат в среду, а затем закрываясь. Только после этого происходит гидролиз связанной АТФ, а высвобождаемая энергия служит для восстановления открытой конфигурации нуклеотидсвязывающего домена.
Авторы нового исследования надеются, что одиночная молекула FRET станет методом выбора для дальнейших исследований транспортеров ABC. «Этот класс транспортеров также участвует в патогенезе многих серьезных заболеваний, включая муковисцидоз, а также в устойчивости к противораковым препаратам», - объясняет Кордес. «Поэтому лучшее понимание их транспортных циклов может открыть новые терапевтические возможности."