Будь то червь, человек или синий кит, вся многоклеточная жизнь начинается с одноклеточного яйца.
Из этой одиночной клетки возникает плеяда других, необходимых для построения организма, причем каждая новая клетка развивается в нужном месте в нужное время, чтобы выполнять определенную функцию в координации со своими соседями.
Этот подвиг является одним из самых замечательных в мире природы, и, несмотря на десятилетия исследований, полное понимание этого процесса ускользает от биологов.
Теперь, в трех знаковых исследованиях, опубликованных в Интернете 26 апреля в журнале Science, исследователи из Гарвардской медицинской школы и Гарвардского университета сообщают о том, как они систематически изучали каждую клетку в развивающихся эмбрионах рыбок данио и лягушек, чтобы составить дорожную карту, показывающую, как одна клетка строит целое. организм.
Используя технологию секвенирования отдельных клеток, исследовательские группы проследили судьбу отдельных клеток в течение первых 24 часов жизни эмбриона. Их анализ раскрывает всеобъемлющую картину того, какие гены включаются или выключаются, и когда эмбриональные клетки переходят в новые клеточные состояния и типы.
Вместе результаты представляют собой каталог генетических «рецептов» для создания различных типов клеток у двух важных модельных видов и обеспечивают беспрецедентный ресурс для изучения биологии развития и болезней.
«Благодаря секвенированию отдельных клеток мы можем за один рабочий день резюмировать десятилетия кропотливых исследований решений, принимаемых клетками на самых ранних стадиях жизни», - сказал Аллон Кляйн, доцент системной биологии HMS и соавтор. - автор-корреспондент двух из трех научных исследований.
С точки зрения биомедицины, эти исходные ресурсы для развития организмов так же важны, как и наличие исходных ресурсов для их геномов, говорят исследователи.
«Используя подходы, которые мы разработали, мы намечаем, каким, по нашему мнению, будет будущее биологии развития, когда она превратится в количественную науку, основанную на «больших данных», - сказал Кляйн.
В дополнение к тому, что она проливает новый свет на ранние этапы жизни, работа может открыть дверь к новому пониманию множества болезней, сказал Александр Шир, профессор молекулярной и клеточной биологии Лео Эриксона. Гарвард и соответствующий автор третьего исследования.
«Мы предвидим, что любой сложный биологический процесс, в котором клетки изменяют экспрессию генов с течением времени, может быть реконструирован с использованием этого подхода», - сказал Шир. «Не только развитие эмбрионов, но и развитие рака или дегенерации мозга».
По одному
Каждая клетка развивающегося эмбриона несет в себе копию полного генома организма. Подобно строителям, использующим только соответствующую часть чертежа при закладке фундамента здания, клетки должны экспрессировать необходимые гены в соответствующее время, чтобы эмбрион мог правильно развиваться.
В своих исследованиях Кляйн сотрудничал с соавторами Марком Киршнером, профессором системной биологии Университета HMS Джона Франклина Эндерса, Шоном Мегасоном, адъюнкт-профессором системной биологии HMS и коллегами, чтобы проанализировать этот процесс у рыбок данио и западных клешней. эмбрионы косолапых лягушек (Xenopus tropicalis), двух наиболее хорошо изученных модельных видов в биологии.
Исследователи использовали возможности InDrops, технологии секвенирования отдельных клеток, разработанной в HMS Кляйном, Киршнером и их коллегами, для сбора данных об экспрессии генов из каждой клетки эмбриона, по одной клетке за раз. Команды коллективно профилировали более 200 000 клеток в разные моменты времени в течение 24 часов для обоих видов.
Чтобы составить карту происхождения практически каждой клетки по мере развития эмбриона, а также точную последовательность событий экспрессии генов, которые отмечают новые состояния и типы клеток, команды разработали новые экспериментальные и вычислительные методы, включая введение искусственной ДНК. штрих-коды для отслеживания родословных отношений между клетками, называемые TracerSeq.
«Понимание того, как устроен организм, требует знания того, какие гены включаются или выключаются, когда клетки принимают решения о судьбе, а не только статическую последовательность генома», - сказал Мегасон. «Это первый технологический подход, который позволил нам систематически и количественно ответить на этот вопрос».
В исследовании под руководством Шира исследовательская группа использовала Drop-Seq - технологию секвенирования отдельных клеток, разработанную исследователями из HMS и Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда - для изучения эмбрионов рыбок данио в течение 12 часов в высокое временное разрешение. Совместно с Авивом Регевом, одним из основных членов Broad, Шир и его коллеги реконструировали траектории клеток с помощью вычислительного метода, который они назвали URD, в честь скандинавского мифологического персонажа, который решает все судьбы.
Schier и его коллеги изучили более 38 000 клеток и разработали клеточное «генеалогическое древо», которое показало, как экспрессия генов в 25 типах клеток менялась по мере их специализации. Объединив эти данные с пространственным выводом, команда также смогла реконструировать пространственное происхождение различных типов клеток у ранних эмбрионов рыбок данио.
Рецепт успеха
Для обоих видов выводы ученых отразили многое из того, что было известно ранее о прогрессии эмбрионального развития, и этот результат подчеркнул силу новых подходов. Но анализы были беспрецедентными в раскрытии во всех подробностях каскадов событий, которые переводят клетки из ранних состояний-предшественников или «универсальных» состояний в более специализированные состояния с узко определенными функциями..
Команды определили трудно поддающиеся обнаружению детали, такие как редкие типы и подтипы клеток, и связали новые и высокоспецифичные паттерны экспрессии генов с различными линиями клеток. В нескольких случаях они обнаружили, что типы клеток появляются намного раньше, чем считалось ранее.
Для ученых, стремящихся ответить на вопросы о болезнях человека, эти данные могут быть очень полезными. В регенеративной медицине, например, исследователи на протяжении десятилетий стремились манипулировать стволовыми клетками в соответствии с определенной судьбой с целью замены дефектных клеток, тканей или органов функциональными. Недавно полученные данные о последовательности изменений экспрессии генов, которые ускоряют появление определенных типов клеток, могут способствовать дальнейшему развитию этих усилий.
«Благодаря этим наборам данных, если кто-то хочет создать определенный тип клеток, теперь у него есть рецепт шагов, которые эти клетки предприняли при формировании в эмбрионе», - сказал Клейн. «Мы в каком-то смысле установили золотой стандарт того, как на самом деле развиваются сложные процессы дифференцировки у эмбрионов, и подали пример того, как систематически реконструировать эти типы процессов».
В сочетании с одной из основных концепций биологических исследований - идеей разрушения системы для изучения того, что происходит - секвенирование отдельных клеток может дать информацию, которую раньше было трудно получить, сказал Кляйн.
В качестве доказательства принципа Кляйн, Мегасон и их коллеги использовали систему редактирования генов CRISPR/Cas9 для создания рыбок данио с мутантной формой хордина, гена, участвующего в определении ориентации развивающегося эмбриона спиной вперед.. Шир и его коллеги применили аналогичный подход, проанализировав рыбок данио с мутацией в другом гене формирования паттерна, известном как одноглазая булавочная головка..
При анализе с помощью секвенирования отдельных клеток ученые подтвердили ранее известные описания мутантов хордина и одноглазой булавочной головки и смогли подробно описать или даже предсказать влияние этих мутаций на развивающиеся клетки и зарождающиеся ткани в целом. эмбрион.
Неожиданно группы независимо друг от друга обнаружили, что на уровне одной клетки экспрессия генов была одинаковой у мутантов и дикого типа, несмотря на потерю основного сигнального пути. Однако пропорции различных типов клеток изменились.
«Эта работа стала возможной только благодаря новейшим технологиям, которые позволяют нам анализировать экспрессию генов в тысячах отдельных клеток», - сказал Шир.«Теперь масштаб намного больше, так что мы можем реконструировать траекторию почти всех клеток и всех генов во время эмбриогенеза. Это почти как перейти от наблюдения нескольких звезд к видению всей Вселенной».
Переосмысление определений
Исследовательские группы также продемонстрировали, как эти данные могут использоваться для ответа на давние фундаментальные вопросы биологии.
Когда Кляйн, Киршнер, Мегасон и их коллеги сравнивали ландшафты состояний клеток между эмбрионами рыбок данио и лягушек, они обнаружили в основном сходство. Но их анализ также выявил множество сюрпризов. Одним из таких наблюдений было то, что гены, маркирующие состояния клеток у одного вида, часто были плохими генами-маркерами того же состояния клеток у других видов. В нескольких случаях они обнаружили, что последовательность ДНК гена и структура кодируемого им белка могут быть почти идентичными у разных видов, но иметь очень разные паттерны экспрессии..
«Это действительно шокировало нас, потому что это противоречит всем нашим интуитивным представлениям о развитии и биологии», - сказал Кляйн. «Это было действительно неприятное наблюдение. Оно прямо бросает вызов нашему представлению о том, что значит быть определенным «типом клеток»».
Причина, по которой эти различия не были обнаружены ранее, как предполагают исследователи, заключается в том, что компьютерный анализ «обращает внимание» на данные способом, принципиально отличным от того, как это делают люди.
«Я думаю, что это отражает некоторый уровень предвзятости подтверждения. Когда ученые находят что-то консервативное между видами, они отмечают это как маркер», - сказал Мегасон. «Но часто все остальные несохраняемые признаки игнорируются. Количественные данные помогают нам преодолеть некоторые из этих предубеждений».
В другом поразительном открытии ученые обнаружили, что процесс дифференцировки клеток в отдельные типы клеток, который, как обычно считается, происходит в древовидной структуре, где разные типы клеток ответвляются от общей клетки-предка, может формировать "петли", а также ответвления.
Например, нервный гребень - группа клеток, которые дают начало различным типам тканей, включая гладкие мышцы, определенные нейроны и черепно-лицевые кости - первоначально возникает из нервных и кожных предшественников, но хорошо известно, что они генерируют клетки, которые выглядят почти идентичными предшественникам костей и хрящей.
Новые результаты показывают, что подобные циклы могут возникать и в других ситуациях. Тот факт, что клетки в одном и том же состоянии могут иметь очень разную историю развития, говорит о том, что наше иерархическое представление о развитии как о «дереве» слишком упрощено, сказал Клейн.
Все три группы также определили определенные клеточные популяции, которые существовали в своего рода промежуточном состоянии «принятия решений». Шир и его коллеги обнаружили, что в определенных ключевых точках ветвления развития клетки, по-видимому, идут по одной траектории развития, но затем меняют свою судьбу на другую траекторию.
Кляйн, Мегасон, Киршнер и их коллеги сделали связанное наблюдение, что на ранних стадиях развития некоторые клетки активировали две различные программы развития. Хотя эти промежуточные клетки в конечном итоге приняли бы единую идентичность, эти открытия дополняют картину того, как клетки развивают свою окончательную судьбу, и намекают на то, что могут быть факторы помимо генов, участвующих в управлении клеточной судьбой.
«В случае с многолинейными клетками мы должны начать задаваться вопросом, определяется ли их окончательная судьба какой-то силой отбора или взаимодействием с окружающей средой, а не только генетическими программами», - сказал Киршнер.
Основа будущего
Вновь созданные наборы данных, а также новые инструменты и технологии, разработанные в рамках этих исследований, закладывают основу для широкого спектра будущих исследований, по словам авторов.
Эволюционные биологи могут собирать больше данных более высокого качества по многим видам, следить за эмбрионами дальше во времени и проводить любое количество экспериментов с возмущениями, и все это может помочь улучшить наше понимание фундаментальных законов биологии и болезней.
Эти ресурсы также могут служить координационным центром для сотрудничества и взаимодействия, поскольку большинство лабораторий не обладают достаточным опытом, необходимым для использования всех полученных данных и информации, отмечают авторы.
«Я думаю, что эти исследования создают реальное чувство общности, когда исследователи задают вопросы и взаимодействуют друг с другом таким образом, что это возвращает нас к более ранним временам в изучении эмбриологии», - сказал Киршнер.
Эти три исследования, по словам Шира, являются примером того, как научное сообщество может работать над дополнительными вопросами, чтобы найти ответы на важные вопросы биологии.
«Вместо того, чтобы конкурировать, наши группы поддерживали регулярные контакты в течение последних двух лет и координировали публикацию наших исследований», - сказал он. «И здорово, что эти три документа дополняют друг друга - в каждом из них освещаются разные способы создания, анализа и интерпретации таких сложных наборов данных».
Следующим концептуальным скачком, как предполагают ученые, будет лучшее понимание того, как принимаются решения о судьбе клеток.
«Прямо сейчас у нас есть дорожная карта, но она не говорит нам, каковы признаки», - сказал Мегасон. «Что нам нужно сделать, так это выяснить, какие сигналы направляют клетки по определенным путям, и какие внутренние механизмы позволяют клеткам принимать такие решения».
Что бы ни ждало нас в будущем, эти наборы данных оставят свой след.
«Прелесть работы над организмом в том, что это все», - сказал Кляйн. «Через десять, 20 лет мы все еще можем быть уверены, что рыбки данио и лягушки будут развиваться по одним и тем же шаблонам».
Все три исследовательские группы сделали свои наборы данных и инструменты доступными в виде интерактивных онлайн-ресурсов с возможностью просмотра.