Создание эффективной генной терапии наследственных заболеваний требует трех ключевых шагов. Во-первых, ученые должны идентифицировать и охарактеризовать болезнь. Во-вторых, они должны найти ответственный ген. И, наконец, они должны найти способ исправить нарушение.
Четыре года назад команда из Пенсильванского университета в сотрудничестве с группой из Японии поставила галочку в первой ячейке этого контрольного списка в отношении формы врожденной куриной слепоты у собак. Теперь в статье в журнале Scientific Reports они объявляют об успехе на втором этапе: они идентифицировали ответственный ген.
«Мы действительно определили точную генетическую мутацию, вызывающую это заболевание», - говорит Кейко Миядера, доцент офтальмологии Школы ветеринарной медицины Пенна и старший автор статьи. «Следующий этап - работа над лечением этого состояния; это еще впереди, и мы очень рады этому».
Люди с врожденной стационарной куриной слепотой (CSNB) имеют практически нормальное зрение днем, но с трудом различают предметы в тусклом свете. Наследственное заболевание присутствует с рождения и может возникать в результате мутаций в ряде генов. В то время как современный мир, как правило, хорошо освещен, эта форма слепоты может серьезно повлиять на качество жизни в районах, где искусственное освещение не так легкодоступно.
В публикации 2015 года в журнале PLOS ONE команда, в которую входят Миядера и Густаво Агирре, профессор офтальмологии и медицинской генетики в Penn Vet, и Рубен Дас, тогда из Penn Vet, а теперь из Медицинской школы Перельмана Пенна, в сотрудничестве с командой под руководством Минео Кондо из Университета Миэ, объявили, что они впервые обнаружили форму истинного CSNB у собак.
В текущей работе исследователи продолжили свое сотрудничество, на этот раз работая над выявлением ответственной генетической мутации. Воспользовавшись относительно доступной технологией секвенирования генома, команда провела исследование ассоциации всего генома, чтобы сузить потенциальные генетические области-кандидаты.
Используя чип, способный идентифицировать изменения отдельных нуклеотидов в 170 000 точках генома собаки, исследователи изучили 12 собак с этой формой CSNB и 11 здоровых собак. Все животные происходят из близкородственного семейства, что помогает выделить различия между ними.
Этот анализ сузил их цель до области генома размером примерно 4 миллиона пар нуклеотидов - все еще слишком большой, чтобы искать ген за геном. Вместо этого они провели секвенирование всего генома и использовали результаты для сравнения с международным набором данных, содержащим геномную информацию более чем 250 собак, и искали гены, в которых у больных собак было две копии мутации, у носителей была одна, а у других собак не было ни одной..
«Мы обнаружили весьма убедительную мутацию, - говорит Миядера. Мутация влияет на ген LRIT3, включая делецию одной пары оснований, что приводит к усечению полученного белка. Примечательно, что мутации LRIT3 также связаны с CSNB у людей.
В своей нормальной форме LRIT3 обеспечивает правильную локализацию белка молекулярного канала, TRPM1, на кончике клеточного типа, прилегающего к светочувствительным фоторецепторным клеткам сетчатки. Этот вторичный слой нейронов сетчатки, называемый биполярными клетками ON, передает сигналы от фоторецепторов на их пути к мозгу. Мутация, по-видимому, специфически влияет на те биполярные клетки ON, которые связаны с клетками-палочками - те, которые сильно активизируются, позволяя видеть в тусклом свете.
Как только они сосредоточились на мутации LRIT3, они смогли подтвердить доказательства того, что это был ответственный ген, изучив ткани пораженных собак и изучив, как наличие нормального по сравнению с мутантным LRIT3 влияет на клеточные и белковые маркеры. и экспрессия TRPM1 в лабораторных экспериментах.
Хотя мутация влияет на функцию биполярных клеток ON, исследователи обнаружили, что структура сетчатки оказалась относительно незатронутой мутацией.
«Это очень важно для разработки генной терапии», - говорит Агирре. «Если структура не на месте, вы не сможете восстановить зрение с помощью такого подхода».
Команда уже работает над разработкой подхода генной терапии для исправления мутации. Усилия влекут за собой другую проблему по сравнению с предыдущими формами слепоты, над которыми работала группа, поскольку нацеливание на биполярные клетки ON требует подхода к сетчатке на другом слое, который не так легко доступен, как клетки фоторецепторов. «Уникальность этой области работы заключается в том, что мы пытаемся воздействовать на тип клеток, который ранее недостаточно использовался в качестве терапевтической мишени», - говорит Миядера.
В результате исследователи надеются, что их работа может привести к разработке стратегий лечения других состояний, связанных с включенным биполярным клеточным слоем.