Ученые находят новые способы улучшить использование фермента CRISPR Cas9 и снизить вероятность нецелевых мутаций у лабораторных мышей, согласно новым результатам исследовательского сотрудничества, в котором участвовал Лорил Наттер, доктор философии, старший директор по науке. и разработка технологий в Центре феногеномики при Больнице для больных детей (SickKids) в Торонто. Выводы, которые помогают ученым понять общую проблему, связанную с редактированием генов, и определить новые стратегии для повышения его точности, были представлены в виде реферата пленарного заседания на ежегодном собрании Американского общества генетики человека в 2019 году в Хьюстоне.
Доктор. Наттер и ее сотрудники из межучрежденческого проекта Knockout Mouse Phenotyping Project (KOMP2) регулярно используют Cas9 и редактирование генов для получения линий лабораторных мышей со специфическими мутациями. В этой работе они часто сталкиваются с вопросами о вероятности нецелевого мутагенеза - непреднамеренных генетических мутаций, вызванных процессом редактирования генов - в их линиях мышей.
"Мы хотели знать: в какой степени нам нужно беспокоиться о нецелевом мутагенезе?" Доктор Наттер объяснил. Демонстрируя степень проблемы на мышах, исследователи надеялись лучше оценить ее на линиях клеток человека, изучаемых в лаборатории, а также разработать новые способы повышения точности редактирования генов на основе Cas9..
Чтобы ответить на эти вопросы, команда доктора Наттера провела 58 экспериментов по редактированию генома мышиных эмбрионов с помощью Cas9 и направляющих РНК, сконфигурированных для индукции конкретной целевой мутации в другом гене, которая передавалась потомкам. Для каждого эксперимента использовали от двух до четырех направляющих, всего 175 различных направляющих РНК. Затем они секвенировали весь геном каждой мыши для поиска возможных дополнительных мутаций. Чтобы получить исходную частоту мутаций, полные геномы линий мышей, получавших Cas9, сравнивали с геномами 25 необработанных контрольных мышей.
В 31 линии мышей, получавших Cas9, исследователи не обнаружили нецелевых мутаций, а в остальных 20 линиях они обнаружили в среднем 2,3 нецелевых мутации. Для сравнения, среди обработанных и необработанных линий мышей они обнаружили в среднем 3 500 встречающихся в природе уникальных мутаций у каждого животного.
«Удивительно, но эти результаты показывают, что количество встречающихся в природе мутаций намного превышает количество, введенное Cas9», - сказал доктор Наттер. «Они также показывают, что при правильном дизайне направляющих РНК нецелевой мутагенез происходит довольно редко».
Результаты также добавляют контекст к использованию инбредных линий лабораторных мышей в генетических исследованиях и предположениям, которые ученые делают при их использовании.
«Исторически мы использовали линии инбредных мышей для изучения генетики у мышей, потому что их геномы отличались только в определенных, определенных местах, и мы предполагали, что любые различия между мышами связаны с этими различиями», - д-р. - объяснил Наттер. «Однако мы обнаружили, что даже среди мышей в одном помете могут быть тысячи естественных генетических различий».
"Наши результаты подчеркивают необходимость осознавать необходимость использования Cas9 и других инструментов в геноме, который может быть не так хорошо определен, как мы думаем", - добавила она.
В качестве следующих шагов доктор Наттер и ее сотрудники планируют изучить, могут ли ферменты, которые ингибируют или усиливают репарацию ДНК, влиять на скорость возникновения новых мутаций. Они также планируют изучить компромисс между повышением эффективности мутагенеза Cas9 и повышением его точности. Учитывая их внимание к производству линий лабораторных мышей, исследователи надеются, что их результаты послужат основой для разработки лучших направляющих РНК, коротких фрагментов РНК, которые позволяют Cas9 связываться с намеченной мишенью и вызывать предполагаемую мутацию.
В более широком смысле они надеются, что их результаты помогут лучше использовать контрольные группы и получить более информированный взгляд на дизайн эксперимента. Они отметили, что эти знания будут особенно важны в исследованиях по редактированию генов с потенциальными терапевтическими применениями, включая исследования безопасности и эффективности методов лечения, основанных на генетике.
Ссылка: L Nutter et al. (2019 18 октября). Резюме: Секвенирование всего генома ставит нецелевой мутагенез Cas9 в контекст генетического дрейфа. Представлено на ежегодном собрании Американского общества генетики человека в 2019 году. Хьюстон, Техас.