В нормальных, здоровых условиях кровообращения фактор фон Виллебранда (vWF) остается сам по себе. Большой и загадочный мультимерный гликопротеин перемещается по крови, плотно свернутый в клубок, места его реакции не видны. Но когда происходит сильное кровотечение, он вступает в действие, запуская процесс свертывания крови.
При правильной работе vWF помогает остановить кровотечение и спасает жизни. Однако от одного до двух процентов населения мира страдают мутациями фактора Виллебранда, которые приводят к нарушениям свертываемости крови. Для пациентов с более редкими, тяжелыми формами может потребоваться очень дорогое лечение в виде замены плазмы крови.
С другой стороны, если vWF активируется там, где он не нужен, это может вызвать инсульт или сердечный приступ.
Лучшее понимание того, как функционирует фактор Виллебранда, может привести к созданию препаратов, которые заменят его у тех, у кого его нет. Это также может привести к разработке новых лекарств или носителей лекарств, которые имитируют поведение белка для более эффективной доставки лекарств.
Имея это в виду, группа исследователей из Университета Лихай работает над тем, чтобы охарактеризовать этот загадочный белок. В недавней статье, опубликованной в журнале Biophysical Journal, они продвигают экспериментальные данные по индуцированному сдвигом расширенному ответу vWF с использованием микрожидкостного устройства и флуоресцентной микроскопии. Кроме того, они используют результаты моделирования тандемной броуновской динамики экспериментально параметризованной грубозернистой модели VWF, чтобы помочь объяснить некоторые из своих основных наблюдений из эксперимента. Эта работа проливает свет на дальнейшие детали индуцированного потоком поведения биомеханического отклика привязанного ФВ и демонстрирует силу и возможности все более сложных крупнозернистых моделей, используемых в тандеме с экспериментом.
Статья под названием «Поведение связанного фактора фон Виллебранда, вызванное сдвигом, вызванная растяжением», написана Сюаньхонгом Ченгом, адъюнкт-профессором материаловедения и инженерии; Алпарслан Озтекин, профессор машиностроения и механики; Эдмунд Уэбб III, доцент кафедры машиностроения и механики; и Франк Чжан, адъюнкт-профессор биоинженерии и машиностроения и механики; а также докторанты Майкл Морабито и И Ван.
vWF на работе
В месте небольшой раны тромбоциты самостоятельно прилипают к участкам, подверженным воздействию коллагена, вблизи отверстия в стенке кровеносного сосуда и действуют как пробка, эффективно останавливая кровотечение. Однако быстрый кровоток затрудняет это действие тромбоцитов. К счастью, фактор фон Виллебранда распознает этот быстрый кровоток и активирует его: «Это событие, активируемое механикой потока, если хотите», - объясняет Уэбб.
Глобулярная молекула разворачивается, как Слинки, растягиваясь в 10 раз по сравнению с первоначальным размером и обнажая свои места реакции. Он цепляется за поврежденную стенку кровеносного сосуда, где обнаженный коллаген - структурный белок стенки кровеносного сосуда - притягивает тромбоциты. vWF затем захватывает тромбоциты из крови, когда они текут, действуя как мост между коллагеном и тромбоцитами.
Хотя биологическая функция vWF уже давно признана учеными, мало что известно об особенностях того, как функционирует vWF, особенно в условиях течения.
«Большинство белков в крови функционируют посредством биохимических реакций», - говорит Ченг. «Этот белок [vWF] также требует некоторой биохимической реакции для своей функции, поэтому ему необходимо захватить тромбоциты, захватить коллаген - это биохимические реакции. В то же время vWF полагается на механическую стимуляцию для выполнения биохимической функции, и что часть малоизвестна. Это то, что мы пытаемся изучить."
Уэбб добавляет: «Некоторые данные, полученные от нашей группы, а также от других групп, указывают на то, что этим биохимическим реакциям каким-то образом способствует наличие некоторого напряжения, притягивающей силы. Так что даже биохимические реакции кажутся несколько механически опосредованными. Опять же, было понятно, что произошло это изменение от компактной, почти шарообразной формы, если хотите, к этой длинной, волокнистой вещи. Но совсем недавно люди указывали, что это не просто так. Чтобы этот химический узел был активен, вы должны тянуть его, вы должны быть в небольшом напряжении локально. Так что это действительно захватывающая система».
Распутывание A2
Фактор фон Виллебранда представляет собой особенно большой белок, состоящий из множества мономеров или молекул, которые могут быть связаны с другими идентичными молекулами с образованием полимера. Внутри каждого мономера vWF находятся разные домены: A, C и D. Каждый домен и каждый из его соответствующих субдоменов имеют свою собственную роль, и многие из этих ролей пока неизвестны. Домен A1, например, связывает vWF с тромбоцитами. A3 связывает vWF с коллагеном. Домен А2 разворачивается, обнажая реакционные сайты белка, и, когда он полностью открыт, обнажает сайт, который позволяет расщеплять молекулу vWF до нужного размера. Члены команды сосредоточились, в частности, на домене A2.
«Я думаю, что понимание этой области и того, как она взаимодействует с потоком, является лучшим вкладом нашей группы», - говорит Озтекин.
Каждый член команды играет определенную роль. Ченг, Чжан и их аспиранты работают над экспериментальной частью проекта; Озтекин, Уэбб и их аспиранты занимаются моделированием. Результаты каждой команды влияют на работу другой.
Чжан, много лет изучавший vWF и принесший проект в Лихай, специализируется на силовой спектроскопии одиночных молекул и механочувстве, или на том, как клетки реагируют на механические раздражители. Он использует специальный инструмент, называемый оптическим пинцетом, который использует сфокусированный лазерный луч, чтобы воздействовать на объекты размером с один атом.
«Оптический пинцет может захватывать крошечные объекты», - объясняет Чжан. «Мы можем взять vWF и в то же время приложить силу, чтобы увидеть, как белок меняет форму, чтобы увидеть, как белки активируются при механическом воздействии или механическом воздействии».
Cheng разрабатывает микрожидкостные устройства небольшого диаметра, которые можно использовать для анализа живых биочастиц. Она и ее команда создают очень маленькие каналы, похожие по геометрии на кровеносные сосуды - порядка 10 микрон в высоту, несколько миллиметров в длину и ширину - таким образом, они могут имитировать условия потока, с которыми встречается в организме vWF. Они метят молекулу vWF флуоресцентно и используют конфокальный микроскоп для захвата видео и неподвижных изображений молекулы, когда она проходит через канал с разной скоростью..
«Когда мы говорим об этом белке при нормальном потоке, это одна конформация, а затем, когда он подвергается воздействию определенных аномальных моделей потока, у вас будет другая конформация», - объясняет Ченг.«Итак, мы пытаемся охарактеризовать или воспроизвести этот процесс в системе in vitro, пытаясь наблюдать, как этот белок меняет конформацию при различных схемах потока. И затем, если у нас есть мутанты по сравнению с нормальным белком, как они будут вести себя по-разному?»
Докторант Йи Ван работает с Ченгом над каналом микрофлюидики, в котором они могут наблюдать, как молекула vWF распутывается и снова складывается в реальном времени под микроскопом. Для этого они должны создать среду, которая имитирует скорость сдвига или изменение скорости кровотока в организме.
Поскольку мы используем довольно высокую скорость сдвига, чтобы ее можно было сравнить с физиологической средой, и из-за ограниченной скорости движения объектива микроскопа, который отображает молекулу, на самом деле довольно сложно зафиксировать движение молекулы. если он движется», - говорит Ван.
Чтобы решить эту проблему, команда привязывает одну сторону молекулы к поверхности канала, чтобы обездвижить ее, применяя силу сдвига. Они успешно засняли разворачивающееся явление на видео.
«Если она [молекула] связана слишком туго, она просто останется там [и не раскроется]», - говорит Ван. «Если он будет слишком рыхлым, все смоется. Поэтому я был очень взволнован, когда нам удалось закрепить его прямо на поверхности, чтобы он мог разворачиваться и складываться».