Что происходит в клетке, когда генетическая информация транслируется в белки? Чтобы изучить этот процесс, исследователи более внимательно изучают одну конкретную биомолекулу внутри клетки: информационную рибонуклеиновую кислоту, сокращенно мРНК. Эта биомолекула играет важную роль во всех клеточных процессах, и она также находится в центре внимания совместных исследований, проводимых двумя исследовательскими группами в Кластере передового опыта Cells-in-Motion в Мюнстерском университете. Одна из групп состоит из биохимиков и возглавляется профессором Андреа Рентмайстер; другой состоит из молекулярных биологов и возглавляется доктором. Себастьян Лейдель. В рамках междисциплинарного сотрудничества исследователям впервые удалось химико-ферментативно пометить важное изменение матричной РНК - так называемую модификацию m6A - и впоследствии точно обнаружить ее с помощью современных молекулярно-биологических методов. «Этот новый подход позволяет нам находить модификации в мРНК с большей степенью точности, чем когда-либо прежде», - говорит Андреа Рентмайстер, профессор Cluster of Excellence, руководившая исследованием. Знание того, где и в какой степени происходят модификации m6A, может впоследствии помочь исследователям более тщательно изучить роль, которую эта модификация играет в физиологических и патологических процессах. Исследование было опубликовано в журнале Angewandte Chemie (International Edition).
Подробный рассказ:
Генетическая информация ДНК транскрибируется в информационную РНК в процессе, известном как транскрипция. После транскрипции мРНК переносит генетическую информацию из ядра клетки в цитоплазму. Там он служит проводником для производства белков. Белки, со своей стороны, являются рабочими лошадками в клетке и выполняют все клеточные задачи.
Как и двухцепочечная ДНК, одноцепочечная РНК состоит из цепочки так называемых нуклеотидов. Однако в РНК также происходит много химических изменений этих нуклеотидов, известных как модификации РНК. Эти модификации происходят после считывания генетической информации. При этом к нуклеотидам присоединяются простые атомные структуры - метильные группы. «Одной из модификаций, которая в настоящее время горячо обсуждается, является N6-метиладенозин, сокращенно известный как m6A», - говорит Андреа Рентмайстер. Есть особая причина, по которой эта модификация очень интересна, а именно потому, что она, по-видимому, отвечает за ряд биологических процессов, например, за циркадные часы. По-видимому, он также играет роль в патологических процессах, например, при некоторых формах рака или вирусных инфекциях.
Биохимики назвали модификации РНК химико-ферментативными
Чтобы лучше понять m6A, исследователи хотят найти ответ на вопрос: где именно в мРНК находится модификация? Чтобы узнать это, они должны пометить его. Для этой цели биологи часто используют антитела, которые прикрепляются к исследуемой молекуле. Этот метод имеет свои ограничения, однако антитела могут связываться не только с модификациями мРНК, но и с соседними нуклеотидами. Это затрудняет точное определение модификаций. «Теперь мы хотели выполнить маркировку химическим способом», - объясняет Андреа Рентмайстер. Итак, она и ее команда впервые использовали пропаргильные группы, немного более длинные углеводородные остатки.
Исследователи соединили пропаргиловые группы с косубстратом фермента и соединили все три компонента с молекулами мРНК в пробирке. По своей химической структуре пропаргил подобен природной молекуле, связанной метилтрансферазой. Метилтрансферазы со своей стороны представляют собой ферменты, отвечающие за модификацию мРНК. Таким образом, метилтрансферазы были способны переносить пропаргильную группу на РНК. Используя так называемую клик-химию, ученые смогли выделить и очистить РНК с пропаргильными группами.
Молекулярные биологи обнаружили модификации РНК с помощью секвенирования нового поколения
Для обнаружения специально помеченных модификаций исследователи использовали специальный фермент для транскрипции мРНК обратно в ДНК. Образовавшаяся нить ДНК является копией предыдущей РНК и может быть исследована молекулярно-биологическими методами. Группа молекулярных биологов из Cells-in-Motion Cluster of Excellence и Института молекулярной биомедицины Макса Планка в Мюнстере во главе с Себастьяном Лейделем секвенировала эту вновь синтезированную цепь ДНК, другими словами, они прочитали последовательности нуклеотидов. При этом исследователи использовали метод, известный как секвенирование следующего поколения, который позволил им чрезвычайно эффективно определять последовательности нуклеотидов.«Этот метод позволяет нам параллельно анализировать тысячи последовательностей», - объясняет Себастьян Лейдель.
Поскольку исследователи пометили модификации пропаргильными группами, ферменты, необходимые для перезаписи РНК, остановились. В результате им не удалось транскрибировать РНК обратно в ДНК. «Ферменты прекратили любую активность в помеченных местах и генерировали своего рода стоп-сигнал», - говорит Катя Хартсток, химик и ведущий автор статьи. Исследователи смогли определить эти стоп-сигналы во время секвенирования, что означало, что они могли обнаружить сайты, в которых произошла модификация мРНК.
После первоначальных экспериментов в пробирке исследователи применили свой новый метод на культуре эпителиальных клеток человека - клетках HeLa. Исследователи накормили клетки так называемым предшественником аминокислоты, меченым пропаргилом, который клетки «съели» и впоследствии начали маркировку. Как уже было установлено в пробирке, пропаргильные группы прикреплялись к РНК с помощью метилтрансфераз и позволяли обнаруживать сайты модификации мРНК с помощью секвенирования Next Generation.
Следующий шаг, который хотят сделать исследователи, - применить свой метод к живым организмам, чтобы изучить значение модификации в их развитии. Рыбки данио хорошо подходят для этой цели, так как они развиваются очень быстро, и поэтому модификации быстрее расшифровываются, а также быстрее удаляются снова.