Несмотря на все внимание, которое микробиом человека привлекал в последние несколько лет, один аспект таких исследований редко попадает в заголовки: сложность наблюдения за тем, как он меняется с течением времени в ответ на различные раздражители. Наиболее распространенным методом анализа является извлечение бактерий из образцов фекалий с последующим секвенированием их геномов, но этот подход, хотя и является минимально инвазивным, теряет важную информацию о том, где и когда происходят бактериальные изменения в кишечнике, что дает ученым неполную картину динамики микробиом.
Теперь новый инструмент, созданный исследователями из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете и Гарвардской медицинской школе (HMS), предлагает решение этой проблемы в виде набора бактериальных генов, которые были сконструированы для обнаружения и регистрации изменений в росте различных популяций бактерий с течением времени в кишечнике живых мышей с точностью до одной клетки и может служить платформой для комплексной диагностики и терапии на основе синтетической биологии для различных приложений в кишки. Исследование опубликовано в Nature Communications.
Время хранения
Система использует колеблющуюся генную цепь, называемую репрессилятором, в качестве своего рода генетических часов для измерения роста бактерий. Репрессилятор состоит из трех бактериальных генов, кодирующих три белка (tetR, cl и lacI), каждый из которых блокирует экспрессию одного из других белков. Гены связаны в петлю отрицательной обратной связи, так что, когда концентрация одного из белков-репрессоров падает ниже определенного уровня, экспрессируется репрессируемый им белок, который блокирует экспрессию третьего белка, и процесс повторяется в циклическая мода.
Когда все три гена вставлены в плазмиду и введены в бактерии, количество завершенных циклов отрицательной обратной связи может служить записью того, сколько клеточных делений претерпели бактерии. Каждый раз, когда бактерии делятся, любые репрессорные белки, присутствующие в их цитоплазме, разбавляются, поэтому их концентрация постепенно падает и запускает экспрессию следующего белка в репрессиляторном цикле. Важно отметить, что цикл репрессилатора повторяется через 15,5 поколений бактерий независимо от того, насколько быстро или медленно растут бактерии. Это позволяет ему действовать как объективное измерение времени, подобно часам.
"Представьте, если бы у вас было два человека, носящих два разных часа, и секундная стрелка на часах одного человека двигалась бы в два раза быстрее, чем у другого", - объяснил первый автор Дэвид Риглар, доктор философии, бывший постдоктор. в Институте Висса и HMS, который в настоящее время возглавляет исследовательскую группу в качестве научного сотрудника сэра Генри Дейла в Имперском колледже Лондона.«Если вы остановите оба часа через один час, они не согласятся, который час, потому что их измерение времени зависит от скорости движения секундной стрелки. Напротив, наш репрессилятор подобен часам, которые всегда движутся со скоростью с одинаковой скоростью, поэтому независимо от того, сколько разных людей носят его, все они будут давать одинаковое измерение времени. Это качество позволяет нам более точно изучать поведение бактерий в кишечнике».
Исследователи соединили каждый из трех белков-репрессоров с флуоресцентной молекулой разного цвета и разработали рабочий процесс визуализации под названием RINGS (вывод о росте на уровне одной клетки на основе репрессилатора), чтобы отслеживать, какой белок экспрессируется в разное время. точек во время роста бактерий. «По мере того, как бактериальная колония растет наружу, схема репрессилятора создает эти различные флуоресцентные, похожие на годичные кольца сигнатуры, в зависимости от того, какой белок-репрессор был активен в единственной бактерии, положившей начало колонии», - сказал Риглар.«Схема флуоресцентных колец показывает, сколько циклов репрессилирования произошло с момента начала роста, и мы можем проанализировать эту схему, чтобы изучить, как скорость роста различается между разными бактериями и в разных средах».
Используя RINGS, команда смогла успешно отследить клеточные деления у нескольких различных видов бактерий, выращенных in vitro, и заметила, что продолжительность репрессиляторного цикла бактерий оставалась неизменной, когда их выращивали на извлеченных образцах кишечника мыши (до имитировать сложную микросреду) или воздействие антибиотика (для имитации стрессовых условий и непоследовательных моделей роста).
Отслеживание изменений
Чтобы оценить эффективность репрессилятора в естественных условиях, команда вводила мышам кишечную палочку, содержащую репрессилятор, перорально, а затем анализировала бактерии, извлеченные из образцов фекалий. Репрессилятор оставался активным до 16 дней после введения, показывая, что долговременная экспрессия осцилляторного гена может поддерживаться в кишечных бактериях у живых млекопитающих. Анализ RINGS успешно обнаружил изменения в паттернах роста бактерий, а бактерии, репрессиляторные контуры которых находились на разных стадиях, можно было «синхронизировать», вводя мышам в питьевую воду соединение, которое останавливало репрессиляторный цикл на данной стадии..
Наконец, исследователи проверили способность репрессилатора обнаруживать различия в скорости роста бактерий, наблюдаемые в результате воспаления кишечника. Мышам давали вызывающее воспаление соединение, а затем бактерии, нагруженные репрессиляторами. Через 15 часов анализ RINGS показал, что бактерии от мышей с воспалением имели репрессилаторы в более широком диапазоне фаз по сравнению с бактериями от контрольных мышей, что позволяет предположить, что воспаление создает среду, которая приводит к непостоянству в росте бактерий, что может привести к дисбалансу в микробиоме кишечника..
«Этот репрессилятор позволяет нам по-настоящему исследовать тонкости поведения бактерий в живом кишечнике не только в здоровом и больном состоянии, но также в пространственном и временном масштабе», - говорит автор-корреспондент Памела Сильвер, доктор философии. Д., который является одним из основных преподавателей Института Висса и профессором биохимии и системной биологии Эллиота Т. и Они Х. Адамс в HMS. «Тот факт, что мы можем повторно синхронизировать репрессилятор, когда он уже находится в кишечнике, а также поддерживать его без необходимости вводить селективные антибиотики, также означает, что мы можем изучать микробиом в более естественном состоянии с минимальными нарушениями».
В дополнение к пониманию динамики микробиома, репрессилятор раскрывает потенциал сложной, основанной на синтетической биологии диагностики и терапии кишечника человека. Потенциальные области применения включают создание системы, запрограммированной на запуск каскада транскрипции генов в определенный момент циркадного ритма, или диагностику, которая фиксирует, сколько времени прошло после обнаружения данного биомаркера.
«Это исследование не только решает конкретную проблему, связанную с мониторингом динамических изменений в физиологии микробиома в живом кишечнике, но и обеспечивает платформу, которая может привести к совершенно новым типам диагностики и даже терапии, зависящей от времени. сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в HMS и программы сосудистой биологии в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в Гарвардской школе Джона А. Полсона. технических и прикладных наук.
Дополнительными авторами статьи являются Дэвид Ричмонд, Лоран Потвен-Троттье, Эндрю Вердегаал, Соменат Бакши, Эмануэле Леончини, Лорена Лайон и Йохан Полссон из HMS, а также Александр Найдич из Института Висса, HMS и Джон из Гарварда. Школа инженерии и прикладных наук им. А. Полсона. Это исследование было поддержано долгосрочной стипендией Human Frontier Science Program, Menzies Foundation, Wellcome Trust, Национальным научным фондом, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов, Гарвардской медицинской школой и Институтом биологически вдохновленной инженерии Висса.