Большинство людей могут назвать по крайней мере несколько костей человеческого тела, но мало кто знает о цитоскелете внутри наших клеток, не говоря уже о «микротрубочках», которые придают ему форму. Теперь группа исследователей из Принстона разрешила давний спор, определив, как именно тело создает эти нити микронного размера.
Используя новый метод визуализации, Сабина Петри и исследователи в ее лаборатории смогли показать, что белок под названием XMAP215, ранее известный только тем, что помогает микротрубочкам расти быстрее и длиннее, необходим для создания ядра каждой микротрубочки. Их работа опубликована в майском номере журнала Nature Cell Biology.
«Наше исследование показывает, что микротрубочки в клетке образуются в результате взаимодействия двух молекул», - сказал Аканкша Тавани, аспирант четвертого курса лаборатории Петри, который является первым автором новой статьи. «XMAP215 функционирует вместе с более крупным белковым комплексом, который образует кольцеобразные структуры, гамма-тубулиновый кольцевой комплекс (g-TuRC)».
«Микротрубочки подобны скелету клетки - они придают клетке ее архитектуру», - сказал Петри, доцент кафедры молекулярной биологии и старший автор статьи. «Помимо этого, располагая органеллы, они также могут служить магистралью для других компонентов. Моторные белки действительно могут «ходить» по этим микротрубочкам. Они действительно имеют фундаментальное значение для клеточной биологии».
В течение 30 лет исследователи в этой области знали, что столбообразные микротрубочки построены из кирпичиков, называемых «тубулином», которые вырастают из крошечного ядра, и большинство согласилось с тем, что g-тубулин был единственным соединением, которое могло создавать это ядро.
Но была проблема, сказал Петри. Те немногие исследователи, которым удалось выделить g-TuRC, обнаружили, что, когда они поместили его в пробирку, он значительно уступал в создании ядер микротрубочек.
«Gamma-TuRC почти ничего не делает», - сказала она. «Он зарождает несколько микротрубочек, но их должно быть тысячи».
Исследователи ломали голову над этим в течение многих лет, ища какой-то другой фактор, который мог бы активировать или усилить g-TuRC. Этот поиск может быть окончен.
«Поле микротрубочек знало [что g-тубулина] недостаточно, и что другие факторы, которые не были известны, также необходимы для полной активности», - сказала Ева Ногалес, профессор молекулярной и клеточной биологии. в Калифорнийском университете в Беркли, который не участвовал в этом исследовании. «Работа Петри и его сотрудников теперь показывает, что XMAP215, ранее считавшийся «полимеразой» микротрубочек, участвующей в удлинении микротрубочек, действует синергетически с g-тубулином, способствуя эффективной нуклеации микротрубочек. Работа дает ответ на эту важную загадку в нашем понимании регуляции микротрубочек в клетке».
Их исследование осложнялось тем, что вообще трудно было увидеть крошечные структуры, объяснил Тавани, аспирант в области химической и биологической инженерии. «В клетке одновременно находятся десятки тысяч таких полимеров, и наши стандартные способы наблюдения за ними под микроскопом не позволяют добиться хорошего разрешения», - сказала она.
Петри использовала классическую метафору поиска иголки в стоге сена, и она сравнила взгляд в микроскоп с взглядом на всю кучу сена. Чтобы решить эту проблему, она адаптировала метод, называемый флуоресцентной микроскопией полного внутреннего отражения (TIRF). Вместо того, чтобы осветить весь микроскопический образец - весь стог сена - она изобразила только щепку толщиной 100 нанометров. (Для справки, человеческий волос имеет ширину около 50 000 нанометров.)
«С помощью TIRF-микроскопии мы не освещаем ничего за пределами этого слоя», - объяснила она.«Мы его не видим. Вот почему мы получаем гораздо более высокое отношение сигнал-шум: мы не видим других вещей, которые в противном случае перекрываются с наблюдением. Поэтому вместо того, чтобы видеть стог сена, который все еще мы можем видеть иголки на стекле… Мы действительно можем видеть, как рождаются микротрубочки, мы можем видеть, как они растут, мы можем видеть, что с ними происходит - при разрешении иглы».
Удачная находка
Тавани не собирался разгадывать тайну того, почему g-TuRC показал себя хуже в пробирках. Она хотела использовать микроскопию TIRF, чтобы наблюдать за ростом микротрубочек, размер которых она надеялась контролировать с помощью XMAP215, белка, который, как известно, стимулирует рост микротрубочек.
Но вместо того, чтобы просто вырастить более длинные микротрубочки, она увидела, что вырастила их намного больше. «Мы добавили этот белок, и он полностью создал взрыв микротрубочек», - сказал Тавани. «Это был один из самых умопомрачительных моментов во всем процессе».
«Намерение состояло в том, чтобы просто изучить, как образуются эти «фейерверки», - сказал Петри. «Так что по счастливой случайности Аканкша хотела сделать их больше, но потом увидела: «Боже мой, здесь больше микротрубочек!» И причина, по которой она смогла увидеть, что образовалось больше микротрубочек, заключалась в том, что мы разработали эту способность визуализации и извлечения. Вот почему никто другой не видел этого раньше».
Их команда показала, что такое же явление наблюдалось в пробирке, где g-TuRC генерировал микротрубочки вместе с XMAP215. В основном это был вклад Рэйчел Кадзик, исследователя с докторской степенью в лаборатории Петри и соавтора статьи, которая очистила g-TuRC и вместе с Тавани очистила XMAP215. G-TuRC представляет собой комплекс из 44 белков, который оказалось очень трудно очистить и изучить за 30 лет, прошедших с момента его открытия.
Используя чистые экстракты каждого белка, команда Петри смогла увидеть, что в пробирке ни один белок не может образовывать микротрубочки без другого.«Если убрать XMAP215, не образуется ни одной микротрубочки. Если убрать g-тубулин, не образуется ни одной микротрубочки», - сказал Петри.
Их открытие потребовало сочетания экспериментов Тавани и Кадзика, рассмотренных с помощью метода микроскопии Петри TIRF. «Это было интересно, - сказал Петри. «Рэйчел пришла из биологии развития, затем в химию, а затем Аканкша перешла из инженерии в биохимию, так что вместе они были суперкомандой».