Плодовая мушка Drosophila melanogaster является мощным модельным организмом для изучения развития и болезней животных и человека. Он недорогой, быстро генерируется, и существует множество инструментов для генетической модификации его клеток. Один инструмент называется двухкомпонентной системой активации Gal4/UAS. Это биохимический метод, используемый для изучения процесса включения гена (экспрессии гена) и функции гена. Хотя он был основой генетики дрозофилы в течение двадцати пяти лет, он эффективно функционирует только в нерепродуктивных клетках, а не в клетках, производящих яйцеклетки. Неизвестно почему. Теперь Стивен ДеЛука и Аллан Спрэдлинг из Карнеги выяснили почему и разработали новый инструмент, который может работать с обоими типами клеток. Исследование опубликовано в журнале Genetics за июнь 2018 года.
Ген Gal4 является фактором транскрипции. Факторы транскрипции кодируют белки, которые включают гены. Белок Gal4 распознает так называемую восходящую последовательность активатора (UAS), которая может индуцировать экспрессию интересующего гена. В 1998 г. на кафедре эмбриологии была создана специальная версия УАС, получившая название УАСп, для работы во время развития яйцеклетки. Но тот факт, что для нерепродуктивных клеток и клеток, образующих яйцеклетку, необходимы разные инструменты, является серьезным ограничением.
Исходный вектор pUASt - молекула, которая переносит чужеродный генетический материал в другую клетку - содержит промотор под названием Hsp70. Как следует из названия, промоторы представляют собой фрагменты ДНК, которые инициируют или способствуют транскрипции генов. Исследователи разработали несколько разновидностей, чтобы улучшить его экспрессию. Hsp70 является членом семейства белков со сходной структурой в большинстве живых организмов и играет важную роль в фолдинге белков и защите клеток от стресса. Механизмы сворачивания белков жизненно важны для жизни и для понимания болезней.
Вариации UAS, однако, не исправили основную проблему плохой генетической активности в женской системе, производящей яйцеклетки, по сравнению с нерепродуктивными тканями. Основным камнем преткновения на пути к получению широко эффективного вектора GAL4 было отсутствие понимания того, почему UASt плохо функционирует в клетках, продуцирующих яйцеклетку, и отсутствие исследований, сравнивающих промоторы UASp и UASt..
DeLuca и Spradling изучали различия между промоутерами UASp и UASt. Их исследование согласуется с предыдущими отчетами о том, что UASt работает лучше, чем UASp, во всех нерепродуктивных тканях, в то время как UASp лучше работает в системе, производящей яйцеклетки самок.
Они также рассмотрели причину крайне слабой экспрессии UASt в женской репродуктивной системе. Доказательства показали, что некодирующие молекулы РНК (называемые piRNA) организовали молчание, ограничивающее экспрессию UASt.
Затем они посмотрели, откуда произошли эти UASt-piRNAs, проверяя, ответственны ли piRNAs Hsp70 за сайленсинг. Их результаты четко показали, что UASt обычно подавляется piРНК Hsp70 и что UASt лучше, чем UASp, в клетках, лишенных piРНК Hsp70.
«Затем мы попытались создать новую версию вектора экспрессии UAS, которая хорошо работает как в нерепродуктивных клетках, так и в системе, производящей яйцеклетки», - заметил ДеЛука. «Мы предположили, что piRNAs Hsp70 могут распознавать UASt РНК, чтобы инициировать сайленсинг piRNA. Чтобы предотвратить распознавание UASt РНК Hsp70 piRNAs, мы урезали нуклеотиды вектора UASt - основные единицы ДНК и РНК - чтобы они были короче, чем одиночная piRNA. с 213 нуклеотидов до 19 нуклеотидов. Мы назвали этот укороченный вариант «UASz», потому что надеялись, что это будет последний вариант, который кто-либо сделает!»
Ученые обнаружили, что экспрессия UASz примерно в 4 раза выше, чем UASp на всех стадиях яйценосной системы.
Спрадлинг заметил: «UASz является превосходным вектором экспрессии по сравнению с UASp во всех тканях, и он эквивалентен UASt во многих, но не во всех, нерепродуктивных тканях. Это однозначное обновление для всех приложений. серьезное препятствие, преодоленное для репродуктивных исследований. Мы надеемся, что это откроет шлюзы исследований в этой и других областях».