Инженеры-биомедики из Университета Дьюка использовали ранее неизведанную технологию CRISPR для точного регулирования и редактирования геномов в клетках человека.
С помощью этого нового подхода исследователи надеются значительно расширить инструменты на основе CRISPR, доступные инженерам-биомедикам, открыв новые и разнообразные границы технологий инженерии генома.
В исследовании, опубликованном 23 сентября в журнале Nature Biotechnology, Чарльз Герсбах, адъюнкт-профессор биомедицинской инженерии семьи Руни в Университете Дьюка, и Адриан Оливер, научный сотрудник лаборатории Герсбаха, руководивший проектом, описывают как они успешно использовали системы CRISPR класса 1, чтобы включать и выключать целевые гены и впервые редактировать эпигеном в клетках человека.
CRISPR-Cas - это защитная система, в которой бактерии используют молекулы РНК и CRISPR-ассоциированные (Cas) белки для нацеливания и уничтожения ДНК вторгшихся вирусов. Открытие этого явления и перепрофилирование молекулярного механизма вызвали революцию в редактировании генома, поскольку исследователи научились использовать этот инструмент для специфического нацеливания и редактирования ДНК в клетках человека.
CRISPR-Cas9, наиболее часто используемый сегодня инструмент для редактирования генома, классифицируется как система CRISPR класса 2. Системы класса 2 менее распространены в бактериальном мире, но теоретически с ними проще работать, поскольку они полагаются только на один белок Cas для нацеливания и расщепления ДНК.
Системы класса 1 не так просты, они полагаются на несколько белков, работающих вместе в комплексе под названием Cascade (CRISPR-ассоциированный комплекс для противовирусной защиты) для нацеливания на ДНК. После связывания Cascade рекрутирует белок Cas3, который разрезает ДНК.
«Если вы посмотрите на отдельные системы CRISPR всех бактерий в мире, почти 90 процентов из них будут системами класса 1», - сказал Герсбах.«Биология CRISPR-Cas - невероятный источник биотехнологических инструментов, но до недавнего времени все смотрели только на маленький кусочек пирога».
Чтобы продемонстрировать возможности системы класса 1, Оливер прикрепил активаторы генов к определенным участкам каскадного комплекса E. coli типа I и нацелил систему на связывание промоторов генов, которые регулируют уровни экспрессии генов. Поскольку она не включила белок Cas3 в эксперимент, не было разрезания ДНК и изменений основной последовательности ДНК. Эксперимент показал, что активатор Cascade не только связывается с правильным сайтом и может повышать уровень целевого гена, но делает это с точностью и специфичностью, сравнимыми с CRISPR/Cas9.
Оливер повторил процесс, используя каскадные комплексы типа I из дополнительного бактериального штамма, который был особенно устойчив в работе с различными целевыми участками. Она также показала, что домен активатора можно заменить на репрессор, чтобы отключить гены-мишени. Опять же, исследователи отметили точность и специфичность, сравнимую с методами CRISPR/Cas9.
«Мы обнаружили, что структура Cascade является удивительно модульной, что позволяет различным сайтам прикреплять активаторы или репрессоры, которые являются отличными инструментами для изменения экспрессии генов в клетках человека», - сказал Оливер. «Гибкий характер Cascade делает его многообещающей технологией инженерии генома».
Герсбаху и Оливеру предложили исследовать более сложные системы CRISPR класса 1 их сотрудники из близлежащего Государственного университета Северной Каролины, профессора Родольф Баррангу и Чейз Байзель, которые сейчас работают в Центре исследований инфекций имени Гельмгольца в Германии. Баррангу - микробиолог, который почти два десятилетия изучал естественную биологию различных защитных механизмов CRISPR, а Бейзель - инженер-химик, работавший с Баррангоу над созданием микроорганизмов с помощью систем CRISPR класса 1. Им обоим было любопытно, сможет ли лаборатория Герсбаха использовать эти системы в клетках человека, подобно их работе с Cas9.
«Эта работа и полученные в результате технологии являются фантастическим примером того, как сотрудничество между дисциплинами и между университетами в Исследовательском треугольнике Северной Каролины может быть высоко инновационным и продуктивным», - говорит Баррангу, заслуженный профессор Тодда Р. Клэнхаммера в области исследований пробиотиков. в Университете штата Северная Каролина.
Теперь команда с оптимизмом смотрит на то, что их исследование и связанная с ним работа других специалистов в этой области будут стимулировать новые исследования систем CRISPR класса 1.
«Целью этого проекта было изучение разнообразия систем CRISPR», - сказал Герсбах. «За последнее десятилетие были опубликованы тысячи статей о CRISPR-Cas9, и тем не менее мы постоянно узнаем о нем что-то новое. В этом исследовании мы применяем этот подход к другим 90% того, что есть».
На данный момент команда показала, что эти системы класса 1 сравнимы с CRISPR-Cas9 с точки зрения точности и применения. По мере того, как они рассматривают будущие направления, им любопытно изучить, чем эти системы отличаются от своих аналогов класса 2, и как эти различия могут оказаться полезными для биотехнологических приложений.
Команда также заинтересована в изучении того, как системы класса 1 могут решать общие проблемы исследований CRISPR-Cas, особенно проблемы, которые усложняют потенциальные терапевтические применения, такие как иммунный ответ на белки Cas и одновременное использование нескольких типов CRISPR для разных геномов. инженерные функции.
«Мы знаем, что CRISPR может оказать большое влияние на здоровье человека», - сказал Герсбах. «Но мы все еще находимся в самом начале понимания того, как будет использоваться CRISPR, что он может делать и какие системы нам доступны. Мы ожидаем, что этот новый инструмент откроет новые области геномной инженерии».