Умный новый микроскоп предоставил ученым место в первом ряду для драмы развития млекопитающих.
Впервые исследователи могут заглянуть внутрь живого эмбриона мыши и наблюдать, как начинает формироваться кишечник, а клетки сердца делают первые пробные сокращения. В течение критического 48-часового окна - когда начинают формироваться рудиментарные органы - ученые могут проследить за каждой эмбриональной клеткой и точно определить, куда она пошла, какие гены включила и какие клетки встретила на своем пути.
Новая работа представляет собой «буквально план построения клеточного разрешения всей мыши», - говорит Филипп Келлер, физик и биолог из исследовательского кампуса Джанелия Медицинского института Говарда Хьюза в Эшберне, штат Вирджиния. Он и его коллеги сообщают о результатах 11 октября 2018 года в журнале Cell. И они делают микроскоп и вычислительные инструменты, построенные в Джанелии, а также все данные изображений бесплатными и общедоступными.
Такие ресурсы имеют решающее значение для ученых, пытающихся вырастить или регенерировать органы или решить однажды проблемы с развитием, возникающие в утробе матери, говорит Кейт МакДоул, биолог-эволюционист из Джанелии и соавтор исследования. «Чтобы сделать что-либо из этого, вам сначала нужно понять, как формируются органы», - говорит она. «Вам нужно увидеть, что происходит в реальном эмбрионе».
Взгляд внутрь
До сих пор лучшие изображения живых эмбрионов исходили от рыб и мух. Десять лет назад Келлер и его коллеги разработали первый «цифровой эмбрион» рыбки данио, разновидность прозрачного полосатого гольяна, часто изучаемого учеными.
Исследователи сканировали эмбрионы рыб с помощью светового листового микроскопа, который пропускает ультратонкие листы лазерного света через образцы, шаг за шагом. Келлер разработал компьютерные программы для обработки всех данных изображений, и в результате удалось получить представление о первых 24 часах развития рыбы с высоким разрешением.
Келлер и коллеги Джанелии следили за работой с цифровым эмбрионом плодовой мухи, о которой сообщалось в журнале Nature Methods в 2014 году. Этих животных относительно просто изобразить, говорит Келлер, особенно рыбок данио. Они прозрачны и не очень чувствительны к свету, что делает их «легкой мишенью для микроскопии».
Мыши - это отдельная история. Поддержание жизни мышиных эмбрионов в лаборатории даже в течение короткого промежутка времени требует тщательного перечня условий. Во-первых, эмбрионы должны быть стерильными; их нужно погрузить в своего рода питательный суп; и уровни газа и температуры должны точно контролироваться. Более того, клетки невероятно чувствительны к свету, ткани могут быть плотными и непрозрачными, а эмбрион не может оставаться неподвижным под микроскопом. Скорее, он закреплен только в одной точке, поэтому он «дрейфует, как маленький воздушный шар», - говорит МакДоул.
Наконец, за временной промежуток, который хотели наблюдать исследователи, от шести с половиной до восьми с половиной дней после оплодотворения, эмбрион вырастает более чем на порядок - почти до трех миллиметров в диаметре, примерно длина кунжутного семени. Для микроскопа эмбрион - движущаяся мишень, постоянно меняющая размер и положение. По словам Келлера, даже человек, разбившийся в лаборатории и настраивающий фокус каждые пять минут в течение двух дней, не смог получить четкие изображения всего эмбриона.
Поэтому его команда пошла по другому пути - они разработали микроскоп, который мог сам делать всю работу.
Умный прицел
В центре микроскопа исследователей Janelia в прозрачном акриловом кубе находится камера для визуализации эмбрионов. Два световых листа освещают эмбрион, а две камеры записывают изображения. Эти компоненты позволяют исследователям наблюдать за некогда невидимым миром раннего развития органов, раскрывая динамические события в деталях с высоким разрешением, которых никто раньше не видел.
Когда сформировалась передняя кишка, команда увидела, что «это не такой медленный нежный процесс», - говорит МакДоул. «Все это просто обрушивается и образует огромную дыру». И нервная трубка, структура, которая позже образует головной и спинной мозг, сплетается вместе, как молния, растягиваясь по всему эмбриону.
Мозг микроскопа оснащен набором алгоритмов, которые отслеживают положение и размер эмбриона. Эти алгоритмы определяют, как световой лист движется через образец, а затем выясняют, как получить наилучшие изображения, удерживая эмбрион в центре поля зрения.
Поскольку эмбрион постоянно меняется, микроскоп должен постоянно адаптироваться, принимая решения за миллисекунды по сотням изображений в сотни различных моментов времени. «Я бы не сказал, что наш микроскоп умнее человека, - говорит Келлер, - но он способен делать то, на что не способен человек-оператор."
Новые инструменты
Для каждого изученного эмбриона исследователи собрали почти миллион изображений. Затем они создали вычислительный инструментарий, чтобы собрать воедино картину дуги развития каждой эмбриональной клетки. Первым шагом было отслеживание каждой клетки в течение 48 часов данных визуализации. Это основывалось на усовершенствованной программе отслеживания клеток, которую команда первоначально разработала для эмбрионов мух и рыбок данио. В сочетании с программой, созданной командой под названием «Статистический векторный поток», исследователи могли работать в обратном направлении, чтобы выяснить, откуда взялась каждая клетка восьми с половиной дневного эмбриона, говорит соавтор исследования Лео Гиньяр, компьютерный специалист из Джанелия. По его словам, это все равно что рисовать карту судьбы и истории каждой клетки.
Без этих программ человеку потребовалось бы два-три года, чтобы отслеживать каждую клетку, говорит Келлер.
Множество других инструментов позволило команде раскрыть тонкости гаструляции, когда эмбрион превращается в многослойную структуру, и раннего органогенеза. Соавторы Janelia Эндрю Бергер, Шринивас Турага и Кристин Брэнсон создали детектор клеточного деления, который автоматически регистрирует, какая клетка делится (и где и когда). И Гиньяр разработал программу для создания виртуального «среднего» эмбриона мыши, выровняв четыре эмбриона вместе в пространстве и времени. (Поклонники «Доктора Кто» узнают название программы, ТАРДИС, намек на машину времени и пространства, которую использовал вымышленный доктор.)
Новый микроскоп является шестым, разработанным командой Келлера за восемь лет его работы в Janelia; каждый поставляется с новыми и улучшенными программными инструментами. Во многих случаях, говорит Келлер, эндоскопы «позволяют проводить принципиально новые типы экспериментов по визуализации», например, наблюдать за развитием целых мышиных эмбрионов.
Их последняя работа затрагивает фундаментальный вопрос биологии, говорит Келлер: «Как перейти от одиночной клетки к эмбриону?»