Пили типа IV (T4P) - удивительные супермолекулярные механизмы, которые управляют подергивающейся подвижностью, секрецией белка и поглощением ДНК у прокариот. T4P работают как крюки для захвата, которые вызывают дергающуюся подвижность бактерий за счет цикла растяжения, прикрепления к поверхности и втягивания, заставляя клетки перемещаться по поверхности, подтягиваясь вдоль нее. Свойства T4P как мотора ранее тщательно изучались с помощью методов биофизики, но механизм регуляции динамики активации T4P в ответ на различные сигналы окружающей среды оставался неясным, в основном из-за того, что многочисленные компоненты взаимодействуют для управления динамикой, а также потому, что T4P очень тонкие. ~ 8 нм в диаметре) и поэтому его трудно наблюдать.
В исследовании, недавно опубликованном в The Proceedings of the National Academy of Science, биофизики Дайсуке Накане и Такаюки Нисидзака из Университета Гакушуин в Токио преодолели эти трудности, разработав простые методы визуализации филаментов T4P и используя оптическую микроскопию для прояснения на механизм регуляции динамики активации Т4Р. Они непосредственно визуализировали динамику T4P на уровне отдельных клеток у Synechocystis sp. PCC6803, модельная цианобактерия, которая демонстрирует отрицательный фототаксис посредством подергивающейся подвижности в ответ на синий свет. T4P может распространяться со всех направлений тела практически сферических клеток Synechocystis, и, таким образом, клетки могут двигаться в любом направлении вдоль поверхности.
Накане и Нисидзака разработали оптическую установку, которая позволяла им одновременно освещать образцы на стеклянной подложке как сбоку, так и вертикально. Во-первых, они использовали световую микроскопию, чтобы непосредственно визуализировать активность T4P как распределение и интенсивность гранул полистирола, захваченных T4P, на поверхности иммобилизованных клеток, контролируемых синим светом. На ячейках, освещенных вертикально синим светом, бусины накапливались равномерно, но при частичном освещении ячейки вертикальным светом только ее правой половины бусы накапливались только в освещенной области. Когда клетки освещались латерально синим светом, гранулы выборочно накапливались на передней стороне клеток (противоположной источнику света), что указывает на повышенную активность T4P там. Это асимметричное накопление предполагает, что филаменты T4P, расположенные на передней стороне клетки, могут вызывать движение вперед, поскольку боковое освещение индуцирует отрицательный фототаксис в направлении этой стороны..
Команда затем непосредственно визуализировала и количественно оценила Т4Ф и его динамику на клетках, пометив клеточный Т4Ф авидином, конъюгированным с FITC, и проведя микроскопическое исследование иммобилизованных клеток, и обнаружила, что накопление и удлинение Т4Ф также активируются в передняя сторона клеток освещена латерально синим светом. Когда они провели тот же эксперимент с мутантом, у которого отсутствует PixD, белок, чувствительный к синему свету, распределение T4P в мутанте было более равномерным, что позволило предположить, что PixD отвечает за асимметричное распределение T4P через неизвестный механизм, который подавляет накопление Т4Р на освещенной стороне.
Эти наблюдения в целом показали, что освещенная клетка дикого типа имеет асимметричное распределение T4P, которое заставляет клетку удаляться от направленного синего света, что это асимметричное распределение вызвано локальной разницей интенсивности синего света, и что расширение T4P активируется в области, где интенсивность света выше. Эти данные кажутся противоречивыми, поскольку известно, что синий свет действует как «репеллент». Однако это можно объяснить ранее описанным микрооптическим эффектом клетки, а именно, когда одна клетка подвергается воздействию коллимированного света, клетка конденсирует свет в сторону, противоположную источнику света, потому что тело клетки работает как линза. Эта стратегия кажется разумной, потому что микроорганизм размером порядка длины волны видимого света не может создать какую-либо структуру для защиты от света.
Наконец, количественный анализ подергивания подвижности и динамики T4P с отслеживанием клеток показал, что 1) филаменты T4P были равномерно вытянуты на клетке в пределах 0.через 2 минуты после воздействия синего света, вызывающего извивающееся движение клетки, 2) затем Т4Р равномерно появлялся во всех областях клеточной поверхности, вызывая беспорядочную подергивающуюся подвижность клетки, и 3) в течение 1 минуты после воздействия активация T4P стал асимметричным вдоль световой оси в ответ на фоточувствительный белок PixD, что привело к направленной подвижности клеток.
Авторы отмечают, что их экспериментальные методы могут быть широко применимы для количественной оценки динамических свойств T4P, которые могут быть общими для других бактерий, таких как Neisseria gonorreae или Pseudomonas aeruginosa, и, возможно, связаны с динамикой архаелл (жгутиков). у архей). Комбинация этой новой экспериментальной системы и мутантов, у которых отсутствуют другие рецепторы света или ключевые белки у различных видов, в ближайшем будущем раскроет более подробные механизмы.
В целом, эти результаты подчеркивают, как система обработки световых сигналов у цианобактерий регулирует динамику T4P, чтобы направлять клетки в определенном направлении. Этот механизм навигации резко контрастирует с механизмом хемотаксиса у бактерий, который действует путем изменения интервала между случайным плаванием и кувырканием.