В борьбе с вирусами, которые вторгаются в повседневную жизнь, очень важно видеть и понимать поле битвы. Ученые из Исследовательского института Моргриджа впервые получили изображения молекулярных структур, жизненно важных для репликации основного класса вирусов в инфицированных клетках.
«Задача немного похожа на то, чтобы быть автомехаником и не иметь возможности видеть двигатель или то, как он собран в деталях», - говорит Пол Алквист, директор вирусологии в Институте Моргриджа и профессор онкологии и молекулярной медицины. вирусологии в Университете Висконсин-Мэдисон.«Эта работа - наш первый взгляд на двигатель».
Исследование, опубликованное 27 июня в журнале eLife, использует новаторскую криоэлектронную томографию, чтобы выявить сложный процесс репликации вируса в ярких деталях, открывая новые возможности для потенциального разрушения, демонтажа или перенаправления вирусного механизма.
Одной из нескольких целей лаборатории Алквиста является понимание репликации генома для вирусов с положительной цепью РНК, крупнейшего генетического класса вирусов, который включает в себя многие патогены человека, такие как вирусы Зика, Денге, атипичной пневмонии и чикунгунья. Группа изучает процессы стратегически, сосредотачиваясь не на мелких деталях одного важного вируса, а на общих принципах, применимых ко всему классу.
И почему упор делается на репликацию генома?
«Большая часть генома вируса, обычно порядка 75 процентов, отдана на репликацию генома», - говорит Алквист. «Вирус говорит нам - голосуя своим самым ценным ресурсом, своей кодирующей способностью, - что это большая работа по заражению».
Этот процесс происходит на мембранах инфицированной клетки. Вирусы образуют компартменты репликации - по существу новые органеллы, - в которых происходит процесс репликации генома. Нодавирус, используемый в качестве модели в лаборатории Альквиста, осуществляет этот процесс на митохондриальной мембране.
Неинфицированная митохондрия имеет две внешние мембраны. В митохондриях, зараженных вирусом, пространство между этими мембранами расширено и заполнено шариками, круглыми везикулами размером около 50 нанометров.
Дезире Бенефилд, научный сотрудник лаборатории Алквиста в Институте Моргриджа, говорит, что все вирусы с положительной цепью РНК полагаются на перестройку мембраны хозяина и формирование компартментов репликации для копирования своего генома. Это делает привлекательную мишень для противовирусных препаратов широкого спектра действия, которые эффективны против широкого спектра вирусов.
«Благодаря этой захватывающей новой структурной информации мы можем больше узнать о том, как формируются и функционируют компартменты», - говорит Бенефилд. «Эта информация будет способствовать нашему пониманию репликации вирусов и даст представление о том, как ее контролировать».
Компартменты репликации, или сферулы, содержат нити РНК, генетический код вируса. Именно в этих шариках происходит синтез РНК. РНК-продукты затем удаляются из сферы и используются для производства большего количества белков или упаковываются в новые инфекционные частицы для создания вирусов следующего поколения.
Новое использование криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) позволило ученым увидеть репликационные компартменты с беспрецедентной детализацией, говорит Бенефилд.
"Мы можем видеть структурные элементы, которые ранее были выведены только из биохимических и генетических экспериментов, а также поразительные новые особенности, которые никогда не могли себе представить."
Традиционная электронная микроскопия имеет свои ограничения и требует ряда шагов, которые являются жесткими для образца: химическая фиксация, окрашивание тяжелыми металлами и заливка в пластик. Процесс медленный, с использованием высокореактивных и опасных химических веществ, а образец фиксируется и, следовательно, отображается в неестественном состоянии.
Подготовка проб для крио-ЭТ проще и дает лучшие результаты. Образец мгновенно замораживается за наносекунду в жидкий этан, охлаждаемый жидким азотом. Поскольку он замораживается так быстро, образец оказывается в ловушке в гораздо более естественном состоянии. Молекулы воды также не успевают организоваться и кристаллизоваться, поэтому лед стекловидный, стеклообразный.
В то время как криокомпонент крио-ЭТ улучшает подготовку образцов, томографический компонент продвигает визуализацию на шаг вперед, создавая 3D-визуализации.
Используя традиционную электронную микроскопию, отсеки репликации выглядели удлиненными, почти в форме футбольного мяча. Техника фиксации уменьшила шарики, и их содержимое сморщилось. Cryo-ET показывает реальность - структуры довольно круглые, что означает, что они находятся под давлением, как воздушный шар, и заполнены нитями РНК, обернутыми как клубок пряжи. Размер шариков варьируется в зависимости от длины копируемой РНК.
«Сначала меня поразило, насколько красивыми и изящными были строения, - говорит Бенефилд. «Я был поражен тем, насколько эффективно вирус воспроизводит свою РНК и как он полностью кооптировал митохондрии клетки-хозяина, чтобы в конечном итоге произвести больше вируса. Это был поистине унизительный взгляд за кулисы действия патогена».
Сферулы имеют шейку вдоль митохондриальной мембраны, которая открывается в цитоплазму. Именно здесь входят ингредиенты для репликации РНК и выходят продукты. Одним из удивительных открытий было существование короноподобной структуры, расположенной на верхней части шеи.
Структура представляет собой хорошо организованную, очень симметричную чашечку с 12 зубцами снаружи. Это структурная особенность, которая, вероятно, скрепляет все вместе. Если везикула представляет собой круглый воздушный шар, находящийся под давлением, то коронка похожа на перевязку горлышка этого воздушного шара.
Новые результаты также показывают, что короны содержат вирусные белки, которые считывают и копируют нити РНК, и могут представлять собой основной двигатель комплекса репликации генома. Предстоит проделать гораздо больше работы, чтобы уточнить форму и функцию этих коронок, но раскрытие их существования и визуализация их структуры и симметрии - это огромные шаги в правильном направлении.
«Если мы хотим манипулировать этими комплексами и контролировать их, мы должны понимать их детальное функционирование», - говорит Алквист. «Вы не можете понять, как что-то работает, если не знаете, как оно выглядит и как оно устроено».
Вирусы с положительной РНК - это всего лишь один из шести различных классов вирусов, говорит Алквист. Становится все более очевидным, что формирование компартментов репликации и, возможно, даже структур, связанных с короной, может быть общим для более чем одного класса.
«Хотя эти классы считаются очень разными, в трех из шести классов есть параллели с точки зрения репликации генома», - говорит Алквист. «Это имеет эволюционные последствия и позволяет нам интегрировать результаты из разных систем, чтобы получить неожиданные новые идеи."