В каждом учебнике по биологии утверждается, что клетки являются строительными блоками жизни. Но исследователи только сейчас начинают понимать их разнообразие. Такие технологии, как секвенирование РНК, позволяют выявить, какие гены экспрессируются в каждой отдельной клетке. Затем все клетки можно расположить систематически, используя аналогичные профили экспрессии. «Всякий раз, когда мы используем такую технологию для исследования органа или организма, мы находим не только знакомые типы клеток, но также неизвестные и редкие», - говорит д-р Ян Филипп Юнкер, руководитель исследовательской группы количественной биологии развития в Макс Дельбрюк. Центр молекулярной медицины Ассоциации Гельмгольца (MDC).«Следующий вопрос очевиден: откуда берутся эти разные типы?» Команда Юнкера сейчас публикует статью в журнале Nature Biotechnology, в которой описывается метод под названием LINNAEUS, который позволяет исследователям определять тип клеток, а также происхождение каждой клетки.
«Мы хотим понять гибкость, с которой развиваются организмы», - говорит Юнкер. Если повреждение происходит во время эмбрионального развития, например, из-за мутации или воздействия окружающей среды, механизмы репарации гарантируют, что животное впоследствии будет выглядеть здоровым. Только родословная каждой клетки может рассказать истинную историю - степень повреждения и механизм восстановления. Даже сердце взрослой рыбки данио может регенерировать после травмы. «Это процесс биологического развития повторяется или происходит что-то новое?» Юнкер недоумевает. «А клетки меняются и берут на себя другие задачи?» Тем не менее, в других случаях отсутствующий тип клеток ответственен за возникновение конкретного заболевания. В будущем исследователи смогут использовать генеалогические деревья всех клеток, прослеживаемых с помощью LINNAEUS, для формулирования новых гипотез относительно подобных вопросов.
Быстрая фиксация вызывает случайное образование рубцов
Техника основана на шрамах в ДНК, которые вместе работают как штрих-код, по которому можно определить родословную каждой клетки. Пока эмбрионы рыбок данио все еще находятся на стадии одной клетки, команда Юнкера вводит систему CRISPR-Cas9. В течение следующих восьми часов Cas9 неоднократно вырезал последовательность, которая точно никогда не понадобится рыбам: ген красного флуоресцентного белка (RFP). Красное свечение эмбриона постепенно тускнеет, а на ранах ДНК образуются тысячи различных шрамов. «CRISPR всегда делает надрез в определенной точке. Но у клеток есть не более 15 минут на восстановление, прежде чем произойдет следующее клеточное деление», - говорит Юнкер. «Заплатки должны быть сделаны быстро, чтобы кусочки хромосом как бы склеивались друг с другом. Вот где случаются ошибки. Шрамы в ДНК имеют случайную длину, и их точное положение также варьируется». Дочерние клетки наследуют генетические шрамы во время клеточного деления. Таким образом, клетки, происходящие от общего предка, можно идентифицировать по их генетическим шрамам.
В то время как секвенирование РНК одной клетки отображает тысячи клеток по типам, рубцы показывают миллионы связей между клетками. Реконструкция родословных деревьев из этого клубка данных представляла собой множество проблем. Некоторые шрамы особенно вероятны. «Это опасно, потому что, если одна и та же последовательность рубцов создается как в клетках сердца, так и в клетках мозга, можно ошибочно предположить, что у них есть общий предок», - говорит Юнкер. Поэтому нам нужно было знать, каким последовательностям мы не можем доверять, и отфильтровывать их». Кроме того, не все рубцы в клетке можно обнаружить, - говорит биоинформатик Бастиан Спаньярд, один из ведущих авторов исследования. - Поэтому мы разработали метод, способный преодоления пробелов в данных, что позволяет нам строить деревья родословных."
Увеличение набора данных
Конечными результатами являются деревья родословных с красочными круговыми диаграммами, где ветви расходятся. Каждое деление представляет собой шрам, и каждый цвет на круговой диаграмме показывает, в каком типе клеток оно встречается. Исследователи могут увеличивать это компактное представление чрезвычайно большого набора данных настолько подробно, насколько они хотят.
«Например, в сердце есть два типа клеток, которые едва различимы. Но деревья клонов показывают, что их развитие очень рано разветвляется в разных направлениях», - говорит Юнкер. «Затем мы хотим увидеть, где эти типы клеток встречаются в сердцах рыб. Это часто дает первое указание на то, какую функцию они выполняют». Его лаборатория продолжает использовать рыбок данио в качестве модельного организма, но Юнкер также видит большой потенциал в применении этой техники к человеческим органоидам. В конечном итоге это может помочь нам понять, какие мутации у пациента вызывают необратимое повреждение деревьев клеточных клонов.