На разработку ушло более 10 лет, но когда дело дошло до раскрытия секретов молекулярной структуры ферментов, настойчивость окупилась. Изучая и сравнивая ферменты двух грибов, разлагающие целлюлозу, исследователи из Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии Министерства энергетики (NREL) точно определили области этих ферментов, на которые можно воздействовать с помощью генной инженерии, чтобы ускорить расщепление целлюлозы.
В недавно опубликованной в Nature Communications статье «Инженерия повышенной активности целлобиогидролазы» описывается длительное исследование NREL грибковых целлобиогидролаз (CBH) - ферментов, использующих гидролиз в качестве основного химического вещества для разложения целлюлозы - Trichoderma reesei (TrCel7A) и Penicillium. funiculosum (PfCel7A). Годы тщательных исследований принесли большие плоды: команда лучше поняла взаимосвязь между структурой и активностью этих ферментов, чтобы предсказать лучшие места для внесения изменений и улучшений.
Как в природных, так и в промышленных процессах ферменты этого семейства являются одними из наиболее важных ферментов для расщепления целлюлозы. Планируемый завод по производству целлюлозного этанола мощностью 2000 тонн в день может потенциально использовать до 5000 тонн фермента в год, и половина этого ферментного коктейля может быть из этого семейства ферментов. «Последние несколько десятилетий предпринимались попытки понять и улучшить биокатализаторы из этого ключевого семейства ферментов», - сказал Грегг Бекхэм, руководитель группы в NREL и старший автор исследования. «Чем эффективнее фермент, тем меньше фермента используется, и, следовательно, процесс дешевле. Однако нам еще предстоит пройти долгий путь, чтобы улучшить способность прогнозирования».
Затем, в 2005 году, исследователи NREL Майк Химмель, Стив Декер и Билл Адни обнаружили CBH из другого гриба, PfCel7A, и обнаружили, что он работает на 60 процентов лучше, чем TrCel7A.«Мы были удивлены, что этот фермент был намного лучше, чем отраслевой стандарт», - сказал Декер, который возглавил задачу после того, как Адни покинул NREL. «За последние несколько лет мы провели множество экспериментов, чтобы убедиться, что это реально. Затем, конечно, мы хотели узнать, почему это лучше».
«Если бы мы могли понять структурные различия, то мы потенциально могли бы использовать эту информацию для разработки лучших ферментов, что, в свою очередь, могло бы помочь снизить стоимость целлюлозного биотоплива и биохимического производства», - сказал Бекхэм. «Учитывая сложность работы с этими ферментами, команде NREL потребовалось семь лет тщательной экспериментальной работы, чтобы разработать инструменты, необходимые для подтверждения того, что на этих двух CBH есть несколько горячих точек, которые можно модифицировать, чтобы улучшить их работу».
По словам Декера, «в то время инструменты для генной инженерии Trichoderma были очень ограничены, но из предыдущей работы мы знали, что у других хозяев были проблемы с экспрессией этих белков. По сути, мы начали с нуля и создали собственную систему штаммов-хозяев, векторов, трансформаций и протоколов скрининга T. reesei. По сравнению с хорошо разработанными системами, такими как E. coli, низкая эффективность трансформации T. reesei, утомительные процессы селекции, медленный рост и низкий выход белка сделали эту операцию сложной задачей. Каждый созданный нами штамм занимал месяцы от проектирования до окончательного тестирования».
Открытие произошло, когда NREL внимательно изучил сходство между TrCel7A и PfCel7A, а затем работал над выявлением различий. Оба фермента имеют трехдоменную архитектуру: молекула, связывающая углевод, которая прикрепляет его к целлюлозе; каталитический домен, расщепляющий целлюлозу; и ссылка, которая соединяет эти два домена вместе. Затем исследовательская группа провела эксперименты по обмену доменами, создав библиотеку химер, представляющую собой набор мутантных ферментов, созданных из двух родительских ферментов.
«С тремя доменами между двумя родителями всего получается восемь комбинаций», - сказал Бекхэм.«Мы проверили различные комбинации, чтобы выяснить, какая область обеспечивает лучшую производительность фермента, и, возможно, неудивительно, что, оглядываясь назад, это каталитический домен».
С этими выводами исследователи затем сравнили каталитические домены TrCel7A и PfCel7A и обнаружили восемь разных областей. Продолжая сужать возможности, команда взяла родителя TrCel7A и внесла модификации, одну за другой, в эти восемь областей и обнаружила две важные модификации, которые привели к тому, что TrCel7A работал почти на уровне родителя PfCel7A.
«Эти два очень небольших изменения в этом огромном белке фактически удвоили эффективность TrCel7A», - сказал Бекхэм. «Это учит исследователей, занимающихся белковой инженерией этих невероятно сложных ферментов, так это тому, что в этом каталитическом домене есть очень незначительные изменения, которые можно модифицировать, чтобы резко повлиять на производительность фермента, делая его способным быстрее расщеплять целлюлозу и, таким образом, позволяя промышленным процессам. использовать меньше ферментов."
«Мы знали, что открытие PfCel7A было важным в то время, но дальнейший путь был не совсем ясен», - сказал Химмель, главный руководитель проекта. «В первую очередь мы занялись наиболее сложным для улучшения семейством целлюлаз, и из этого следует, что ферменты из других семейств, разлагающие биомассу, можно сделать максимально активными в более упорядоченном процессе с меньшими исследованиями и разработками. Это было слияние экспериментальной биохимии и вычислительная наука, которая привела это исследование в Nature Communications, и этот результат был возможен только при постоянном финансировании со стороны Управления биоэнергетических технологий».
Конечная цель команды NREL - помочь другим исследователям просеять горы геномных данных, чтобы найти лучшие ферменты, основываясь только на их генетической последовательности. «Через 10 лет было бы очень интересно иметь возможность работать с тысячами последовательностей ферментов из этого семейства и предсказывать, какие из немногих следует попробовать», - сказал Бекхэм.«Это исследование - лишь один шаг на очень долгом пути, но это достойная цель».