Многие опасные для жизни заболевания вызываются или усугубляются простым изменением одного нуклеотидного строительного блока в универсальном генетическом коде ДНК. Такие «точечные мутации» могут превратить одну клетку в организме человека в раковую клетку, которая затем перерастет в опухоль, или они могут превратить чувствительные к антибиотикам бактерии в устойчивые к антибиотикам бактерии, вызывающие неизлечимые инфекции. В идеальном мире клиницисты могли бы удалять клетки с такими вредными точечными мутациями сразу после их создания, чтобы гораздо эффективнее бороться с болезнями.
Исследовательская группа из Института биологической инженерии Висса сообщает в Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), что она сделала первый шаг к этой цели, преобразовав систему инженерии генома CRISPR/Cas9 в инструмент наблюдения за геномом. Исследователи во главе с членами основного факультета Института Висс Джорджем Черчем и Джеймсом Коллинзом разработали метод предотвращения мутаций in vivo, который позволяет ферменту Cas9, расщепляющему ДНК, различать целевые участки генома, отличающиеся одним нуклеотидом, и исключать только нежелательный. В экспериментальных исследованиях, проведенных на бактериальных штаммах E. coli, выращенных в культуре или в желудочно-кишечном тракте мышей, этот подход может предотвратить выживание устойчивых к антибиотикам вариантов.
Фермент Cas9 направляется к своей геномной последовательности-мишени с помощью небольшой направляющей РНК с комплементарной последовательностью. Помещенный в нужное положение на интересующий ген, Cas9 действует как молекулярная пара ножниц, разрезая последовательность-мишень в определенном месте. Если это преднамеренно введенное повреждение исправить, это позволит биологам редактировать геном клеток, но если его не исправить, это приведет к гибели клеток. Тем не менее, несмотря на эффективность системы в поиске и вырезании целевых последовательностей в геноме многих организмов, неспецифическая активность, которая позволяет Cas9 произвольно врезаться во вторичные, не полностью идентичные сайты, по-прежнему представляет проблему для инженеров генома. Это также означает, что последовательность-мишень, несущая нежелательную точковую мутацию, часто не может быть достаточно отличима Cas9 от ее нормального аналога и избирательно удалена. Даже дизайнерские ферменты Cas9, разработанные для большей специфичности, до сих пор не в состоянии полностью решить эту проблему.
«Сосредоточившись вместо этого на характеристиках направляющей РНК, наш подход резко повышает специфичность Cas9 до уровня, при котором можно четко различить однонуклеотидные полиморфизмы и стереть нежелательные генетические варианты», - сказал Джордж Черч, доктор философии, который также является профессором генетики в Гарвардской медицинской школе (HMS) и медицинских наук и технологий в Гарварде и Массачусетском технологическом институте (MIT).«Наш метод открывает совершенно новый взгляд на профилактику болезней в будущем».
Предыдущие исследования показали, что, как это ни парадоксально, определенные несоответствия между направляющей РНК и ее последовательностью-мишенью не влияют на способность Cas9 расщеплять определенный участок ДНК. «Мы предположили, что для данной пары мишеней, отличающихся одной точечной мутацией, в направляющей РНК может быть идентифицирован набор несоответствий, которые устранят активность Cas9 в нормальной последовательности, сохраняя при этом устойчивую активность в отношении последовательности с вредной точечной мутацией., Это остановит клетку с мутацией сразу после ее рождения», - сказал Алехандро Чавес, доктор философии, первый и соавтор исследования, который в качестве постдокторского научного сотрудника в HMS был со- наставником Черча и Коллинза, а сейчас является доцентом Колумбийского университета.
Для разработки своего подхода команда использовала известные точечные мутации, которые происходят в бактериальных ферментах, придавая патогенам устойчивость к антибиотикам. Сосредоточившись на нескольких из этих мутаций и проведя скрининг вариантов направляющих РНК с различными комбинациями несоответствий, они смогли идентифицировать специфические направляющие РНК, которые стимулировали активность Cas9 в отношении последовательностей мутировавших генов, но оставили нетронутыми нормальные аналоги.
«Система предотвращения мутаций поддерживала чувствительность к антибиотикам не только у штаммов E. coli, культивируемых в стандартных лабораторных условиях, но и у бактерий, которые использовались для колонизации желудочно-кишечного тракта мышей-гнотобиотиков. дозирования и продемонстрировал, что система устойчива даже при потенциально значительном воздействии окружающей среды», - сказал соавтор Бенджамин Прюитт, бывший научный сотрудник Института Висса, а ныне ведущий инженер по исследованиям и разработкам в ReadCoor Inc.
Помимо своего потенциала для предотвращения болезней в будущем, исследователи считают, что их система предотвращения мутаций могла бы быть немедленно использована для помощи биотехнологической промышленности в защите крупномасштабных культур от приобретения мутаций, которые делают их непродуктивными или подверженными заражению, а также для изучения микробная эволюция.
Эта стратегия дает нам возможность изучать механизмы эволюции микроорганизмов. Например, теперь мы можем предотвращать часто возникающие мутации, придающие устойчивость к антибиотикам, и задаваться вопросом, какие другие генетические изменения могут привести к такому же результату. Это может улучшить наше понимание механизмов резистентности и потенциально предложить новые терапевтические точки входа», - сказал Джеймс Коллинз, доктор философии, который также является профессором медицинской инженерии и науки в Массачусетском технологическом институте (MIT) и профессором биологической инженерии. в Массачусетском технологическом институте.
«Эти совместные усилия в Институте Wyss привели к совершенно новой инновации в области CRISPR/Cas9, которая может привести к совершенно новым способам профилактики и лечения широкого спектра заболеваний», - сказал основатель Института Wyss. Директор Дональд Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в HMS и программы сосудистой биологии в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в Гарвардском университете имени Джона А. Школа инженерии и прикладных наук Полсона.