UT Исследователи из Юго-Запада сегодня сообщают о первом использовании полногеномного скрининга CRISPR для идентификации гена, который помогает клеткам противостоять флавивирусной инфекции. Этот неприятный класс патогенов включает вирус Западного Нила, лихорадку денге, вирус Зика и желтую лихорадку.
В исследовании, опубликованном в журнале Nature Microbiology, команда под руководством доктора Джона Шоггинса, доцента кафедры микробиологии, использовала передовую технологию CRISPR для идентификации гена IFI6 как мощного противовирусного гена, нацеленного на флавивирусы. Затем исследователи использовали традиционные исследования клеточных культур, чтобы подтвердить роль гена в защите от заражения вирусами Зика, Западного Нила, денге и желтой лихорадки.
«В других исследованиях генетический скрининг CRISPR использовался для выявления клеточных генов, необходимых для заражения флавивирусами. Наше исследование является первым, в котором эта технология используется для выявления клеточных генов, подавляющих инфекцию», - сказала доктор Шоггинс, Нэнси Кейн. и Джеффри А. Маркус, стипендиат медицинских исследований, в честь доктора Билла С. Вауэлла и исследователя Фонда Клейтона.
У млекопитающих клетки естественным образом защищаются от вирусной инфекции с помощью интерферона, молекулы, которая запускает систему предупреждения об обнаружении вируса и о том, что клетки должны задействовать свои системы защиты от вирусов. Клетки делают это, активируя сотни интерферон-стимулированных генов», - сказал он. «Флавивирусы вызывают серьезные заболевания человека, а интерферон участвует во врожденном иммунном ответе организма на эти вирусы».
Доктор. Шоггинс сказал, что команда использовала недавно разработанную технологию полногеномного скрининга CRISPR, чтобы определить, какие из интерферон-индуцированных генов играют главную роль в подавлении флавивирусной инфекции. Он высоко оценил работу аспиранта и ведущего автора Блейка Ричардсона и соавтора доктора Майкке Олсона, старшего научного сотрудника его лаборатории. «Блейк выполнил всю фенотипическую и механистическую работу по изучению того, как IFI6 ингибирует флавивирусы, а доктор Олсон провел скрининг CRISPR, который позволил нам выявить IFI6 как мощный супрессор флавивирусной инфекции», - сказал он..
В скрининге CRISPR мы использовали клетки печени человека и отключали каждый ген в геноме - около 19 000 генов - по одному. Затем мы стимулировали клетки интерфероном, зная, что в норме такая стимуляция позволяют клеткам сопротивляться вирусной инфекции. Для клеток, которые не сопротивлялись инфекции - из-за отсутствия гена из-за нокаута CRISPR - мы использовали секвенирование следующего поколения, чтобы выяснить идентичность соответствующих генов», - сказал он.
Доктор. Шоггинс объяснил, что технология редактирования генов CRISPR сделала такое исследование чрезвычайно эффективным, раскрыв заметную роль IFI6 в ингибировании флавивирусов.
«Великолепие технологии заключается в том, что все эти CRISPR-целевые клетки объединены всего в нескольких больших чашках для культивирования клеток. Клетки также имеют штрих-код, чтобы вы знали, какой ген отсутствует в каждой клетке, когда вы наблюдаете, как они реагируют на добавление интерферона», - сказал он.
«Технология очень крутая», - добавил он.
В исследованиях клеточных культур ген IFI6, по-видимому, работающий через свой белковый продукт, также называемый IFI6, ингибировал желтую лихорадку, флавивирус, который, как известно, поражает печень. По его словам, клетки с работающим геном IFI6 также ингибируют вирусы денге, Зика и Западного Нила. Исследователи подтвердили эти результаты на клетках печени, повторив эксперимент на клеточных линиях почек и кожи, а также на нейронах.
Будущая работа повлечет за собой углубление в молекулярный механизм белка IFI6, в надежде, что эти знания могут стать основой для разработки методов лечения, нацеленных на флавивирусную инфекцию.
Спорадические случаи заболевания Западным Нилом были зарегистрированы этим летом в Соединенных Штатах, сказал он, добавив: «Зика пошла на убыль, но я думаю, что люди все еще хорошо это помнят; лихорадка денге является постоянной проблемой в тропическом климате, и есть в настоящее время вспышка вируса желтой лихорадки в Бразилии."
В более ранних исследованиях доктор Шоггинс и другие исследователи идентифицировали другие возможные белки устойчивости к флавивирусам, используя методы скрининга, отличные от CRISPR, но технология CRISPR делает IFI6 более заметной ролью, сказал он.
Вопросы, на которые еще предстоит ответить, включают в себя вопрос о том, дадут ли скрининг CRISPR в других типах клеток другие результаты. Это исследование было сосредоточено на клетках печени, потому что оно началось с исследования желтой лихорадки, которая, как известно, поражает печень. Зика, как известно, поражает клетки головного мозга, но генетический скрининг нейронов с помощью CRISPR представляет логистические проблемы, пояснил он.