Исследователи использовали анализ «флуоресцентной гибридизации in situ» (FISH) в течение десятилетий, чтобы буквально выуживать специфические последовательности ДНК и РНК в неповрежденных клетках и тканях в их бескрайних морях молекул нуклеиновых кислот. Благодаря своей способности выявлять под микроскопом определенные последовательности в точных местах, где они находятся, FISH стал популярным методом диагностики хромосомных аномалий, исследования трехмерной организации геномов в ядрах клеток, анализ непосредственных продуктов экспрессии генов, известных как матричные РНК, и многое другое.
Однако по-прежнему сложно выделить с помощью FISH последовательности, которые встречаются редко, особенно в толстых тканях, испускающих неспецифическую фоновую флуоресценцию, и обнаружить множество целей одновременно в мультиплексном анализе. Было разработано несколько методов, которые могут усиливать более слабые сигналы FISH, но их нельзя легко настроить, они не могут одновременно визуализировать большое количество целевых молекул ДНК или РНК, они дороги и сложны в использовании..
Совместная исследовательская группа из Гарвардского института биологической инженерии им. а также возможности настройки и мультиплексирования анализа FISH. Команда продемонстрировала, что SABER усиливает сигналы FISH на различных мишенях РНК и ДНК в разных слоях сетчатки мыши и одновременно визуализирует до 17 различных областей-мишеней на Х-хромосоме человека. Кроме того, они использовали SABER в качестве эффективного инструмента для идентификации геномного элемента, который контролирует транскрипцию определенного гена, экспрессируемого в определенном типе нейрона сетчатки. Их исследование опубликовано в журнале Nature Methods..
Благодаря SABRE-амплифицированному анализу FISH и его чувствительности, мультиплексирующему потенциалу, практичности и экономической эффективности мы создали способ преодолеть основные ограничения существующих методов и предоставить исследователям более мощный инструмент для широкого спектра анализов., начиная от фундаментальных исследований и заканчивая открытием биомаркеров и разработкой терапевтических средств», - сказал профессор профессора генетики и Неврология в Институте Блаватника в HMS, и Брайан Беливо, доктор философии, бывший научный сотрудник Дэймона Руньона в группе Инь, а ныне доцент кафедры геномных наук Вашингтонского университета в Сиэтле.
Инь также является соруководителем Инициативы молекулярной робототехники Института Висса и профессором системной биологии в Гарвардской медицинской школе; и Чепко также является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза и членом Гарвардского института стволовых клеток.
В SABER исследователи сначала запрограммировали метод «Реакция обмена праймерами» (PER), о котором ранее сообщала группа Инь, для синтеза более длинного конкатемера идентичных более коротких последовательностей с помощью каталитической самосворачивающейся шпильки ДНК. Этот разработанный механизм имеет сходство с природным ферментативным механизмом, который удлиняет «теломеры» на концах хромосом с идентичными повторами ДНК, чтобы защитить их от деградации, но его можно запустить в пробирке..
Сгенерированные PER конкатемеры затем гибридизуются с помощью коротких комплементарных последовательностей хэндлов с целевыми последовательностями ДНК или РНК в фиксированных клетках и тканях, где они образуют каркас с несколькими сайтами связывания для коротких флуоресцентных олигонуклеотидов («имиджеров»), добавляемых затем.«В отличие от обычного FISH-анализа, SABER позволяет нам связывать не только одну, но и множество молекул флуоресцентного красителя с одной нуклеиновой кислотой-мишенью, что может значительно повысить силу сигнала, исходящего от его местоположения внутри клетки, и мы можем еще больше усилить его, создавая разветвленные структуры на дополнительных этапах гибридизации, с дополнительными конкатемерами, выращенными из внутренних точек ветвления уже существующих конкатемеров», - сказала Джоселин Киши, доктор философии, соавтор исследования и научный сотрудник, работающий с Инь, который разработал SABRE с Беливо. «Это открывает массу новых возможностей».
SABER позволяет нам настраивать мощность сигнала в соответствии с обилием и локализацией конкретных РНК и ДНК-мишеней в анализе FISH, а поскольку конкатемеры для нескольких целей могут быть синтезированы заранее, SABER предоставляет нам стандартизированные наборы зондов, которые можно легко создавать и повторно использовать в различных исследованиях», - сказал Беливо.«Кроме того, многократно вымывая из образца имиджеры, комплементарные одному набору мишеней, и заменяя ими имиджеры, которые связываются с другими мишенями, в процессе, который мы называем ДНК-обменом, мы смогли еще больше мультиплексировать наш подход».
Спектральные особенности различимых флуоресцентных красителей позволяют исследователям анализировать до четырех мишеней одновременно с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. С помощью DNA-Exchange набор имиджеров можно вымыть из образца и заменить другим, связывающимся с конкатемерами, генерируемыми PER, в разных сайтах-мишенях, и этот процесс можно повторять несколько раз. Используя потенциал мультиплексирования «Exchange-SABER», команда визуализировала 17 различных областей человеческой Х-хромосомы одним махом, используя тот же тип микроскопического оборудования..
Применяя SABRE к толстым тканям, группа Констанс Чепко из HMS продемонстрировала эффективность и полезность метода на сетчатке, которая организована в слои с большим разнообразием типов нервных клеток.«Ранее мы применяли секвенирование отдельных клеток к диссоциированной ткани сетчатки, но не смогли использовать полученные маркеры для одновременной идентификации многих типов клеток в интактной ткани», - сказал соавтор Сильвен Лапан, доктор философии, научный сотрудник Cepko. группа. «Обеспечив мультиплексное обнаружение транскриптов маркеров, SABER позволяет нам замкнуть этот цикл и добавить пространственное измерение в наш анализ».
Ключом к их анализу был метод, разработанный для исследования соавтором Эммой Уэст, который, основываясь на флуоресцентном окрашивании клеточной поверхности, может с помощью вычислений отображать все клетки, содержащиеся в поперечном сечении сетчатки, в определенных положениях. Это позволило команде сопоставить отдельные сигналы, полученные с помощью анализа FISH с расширенным SABRE, с точными трехмерными пространствами, занятыми клетками. «Моделируя клеточные координаты и положения транскриптов, мы можем создать цифровое представление нашей ткани, которое является количественным на уровне отдельных клеток. Это полезно не только для идентификации типов клеток, но также для анализа фенотипов и активности введенных генетических элементов. - сказала соавтор Эмма Уэст, аспирант группы Чепко.
Кроме того, команда использовала SABER-FISH в качестве эффективного инструмента для идентификации геномных элементов, известных как энхансеры, которые управляют экспрессией генов в определенных типах клеток сетчатки. «Мы ввели конструкции рекомбинантной ДНК в сетчатку, в которой эти элементы были индивидуально связаны с репортером, и, выполнив анализ SABER-FISH для количественной оценки числа копий конструкций в отдельных клетках, а также экспрессии репортера, мы смогли чтобы сопоставить активность одного конкретного энхансера с экспрессией конкретного типа клеток», - сказал Лапан.
«Чувствительность и более простой и дешевый рабочий процесс SABRE-FISH позволяют нам собирать гораздо больше информации из экспериментов, в которых мы манипулируем сетчаткой, чтобы понять регуляторные сети, управляющие ее развитием, и оценить эффективность наши подходы генной терапии к глазным заболеваниям», - сказал Цепко. «Важно, что этот подход может аналогичным образом улучшить исследования многих других типов тканей и органов."