Почти каждая клетка человеческого тела, от бьющихся клеток сердца до иммунных клеток, пожирающих бактерии, питается от химической энергии, вырабатываемой специализированными органеллами, называемыми митохондриями. В процессе выработки энергии образуются отходы, которые могут быть высокотоксичными, поэтому, как и настоящие электростанции, эти органеллы требуют жесткого контроля качества и надзора.
Эта задача не на жизнь, а на смерть обеспечивает выживание клетки и организма, которому она принадлежит. Сбои в способности клетки удалять поврежденные митохондрии связаны с состояниями, варьирующимися от рака до нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезни Паркинсона, при которой энергоемкие нейроны очень уязвимы для токсического воздействия дефектных митохондрий.
В выпуске журнала Molecular Cell от 19 апреля ученые Гарвардской медицинской школы сообщают о разработке нового метода анализа с беспрецедентной количественной точностью того, как клетки инициируют удаление дефектных митохондрий в результате клеточной аутофагии, или «самопоедания»., система. Методология позволила им впервые изучить этот процесс в нейронах человека, полученных из стволовых клеток.
Сделав «цифровые снимки» белкового ландшафта, когда клетки помечают поврежденные митохондрии для аутофагии, исследовательская группа создала самую четкую на сегодняшний день картину динамики этого процесса, включая абсолютные измерения реакций модификации белков и их количество и меняется со временем.
Результаты подготовили почву для детального изучения связей между митохондриальным повреждением, гибелью клеток и болезнями, а также установили технологический подход, который можно использовать для раскрытия механизмов дефектных клеточных путей во многих других контекстах, говорят авторы..
«Если когда-либо будет лекарство, которое нацелено на этот путь с целью лечения болезни Паркинсона или других нейродегенеративных заболеваний, нам понадобится этот уровень детализации, чтобы понять, как работают кандидаты в лекарства», - сказал старший исследователь. автор Дж. Уэйд Харпер, профессор молекулярной патологии HMS Bert and Natalie Vallee и заведующий кафедрой клеточной биологии.
Молекулярная сигнальная система для контроля качества митохондрий включает два фермента: протеинкиназу PINK1, которая химически модифицирует белки с помощью фосфата, и убиквитинлигазу PARKIN, которая маркирует целевые белки с помощью молекулы, называемой убиквитин.
В нормальных условиях здоровые митохондрии несут небольшое количество PINK1 на своей внешней поверхности. Однако при повреждении митохондрии накапливают PINK1, который переносит фосфат в PARKIN для его активации.
После активации PARKIN переносит убиквитин на различные белки, создавая «убиквитиновую оболочку» на поверхности митохондрий. Когда достигается определенный порог убиквитина, запускается механизм клеточного «самопоедания», что приводит к деградации митохондрий.
Мутации как в PINK1, так и в PARKIN были связаны многочисленными исследованиями с болезнью Паркинсона, которая включает гибель определенных нейронов и накопление неправильно свернутых белков в мозге. Исследователи добились больших успехов в описании пути PINK1-PARKIN, но многие из его критических особенностей остаются плохо изученными.
Пошив пальто
Убиквитин, как известно, маркирует белки-мишени на определенных остатках аминокислоты лизина. Однако это происходит только для небольшого подмножества остатков лизина, и точное определение того, какие лизины модифицированы и почему, было сложной задачей для исследователей, особенно для более чем дюжины мишеней PARKIN на поверхности митохондрий. Кроме того, количество этих мишеней было неясным, что могло повлиять на процесс убиквитинирования.
Предыдущая работа лаборатории Harper в сотрудничестве со Стивом Гиги, профессором клеточной биологии HMS, позволила установить методы, позволяющие обнаруживать отдельные остатки лизина в белках, связанных с убиквитином.
Исследовательская группа расширила этот подход в текущем исследовании. Под руководством ведущего автора Альбана Ордюро, научного сотрудника HMS в области клеточной биологии, они разработали новый метод - мониторинг целевых параллельных реакций (Pt-PRM) PARKIN - для оценки ландшафта убиквитилирования белков, участвующих в контроле качества митохондрий, с беспрецедентным уровнем детализации..
Они также создали библиотеку эталонных пептидов, которая позволила им измерить точное количество мишеней PARKIN и отдельных событий убиквитинирования в поврежденных митохондриях.
По сути, эталонная библиотека пептидов позволила исследователям «подсчитать» события убиквитинирования сайт-специфическим образом более чем дюжины митохондриальных поверхностных белков одновременно в масс-спектрометре.
В сочетании с измерениями, зависящими от времени, после повреждения митохондрий, метод создает «цифровой снимок» событий убиквитилирования на поверхности митохондрий, раскрывая не только специфичность места модификации, но и обеспечивая количественную картину митохондриального ландшафта..
Включив эталонные пептиды, которые обнаруживают события PINK1-зависимого фосфорилирования, команда также смогла интегрировать целевое фосфорилирование с убиквитинированием.
«Это один из самых подробных анализов пути убиквитина, который когда-либо проводился. Нет другого исследования, которое использовало бы этот уровень сложности для анализа такого процесса», - сказал Харпер..
Цифровой снимок
Новая методика позволяет проводить точные, абсолютные измерения событий убиквитинирования белка, в отличие от предыдущих методов, которые не являются количественными и не обеспечивают специфичность сайта убиквитилирования.
«Теперь этот подход дает нам полный динамический диапазон», - сказал Харпер. «Мы можем измерить более трех порядков, чтобы лучше понять кинетику, стехиометрию, пространственную организацию, интеграцию с фосфорилированием и многие другие особенности», - сказал Харпер..
Благодаря повышенной точности команда провела первый количественный анализ нативных событий, связанных с убиквитилированием, в нейронах, полученных из генетически модифицированных стволовых клеток человека, система, более подходящая для изучения болезней человека, чем предыдущие модели.
Это включало анализ дофаминергических нейронов, потеря которых является основной характеристикой болезни Паркинсона, проведенный в сотрудничестве с Ли Рубином, профессором биологии стволовых клеток и регенеративной биологии в Гарварде. До сих пор большинство исследований в этой области проводилось на иммортализованных раковых клетках человека (HeLa), сконструированных для экспрессии PARKIN на неестественно высоких уровнях, чтобы ученые могли измерить их активность.
Harper, Ordureau и коллеги сравнили две клеточные модели в своем анализе, выявив сходства и различия в специфичности и времени модификаций. Они также обнаружили специфические остатки лизина на белках, которые избирательно убиквитилировались в нейронах, но не в клетках HeLa, и наоборот. По словам авторов, биологические последствия этих различий остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения.
Анализ помог пролить новый свет на обсуждаемые в настоящее время вопросы в этой области, например, помечают ли цепи убиквитина белки без разбора в митохондриях или они нацелены на определенные белки.
Ответ может быть "это зависит". В целом убиквитинирование, по-видимому, зависит от количества белка, но исследователи также обнаружили доказательства селективности, особенно в отношении определенных структурных элементов белков-мишеней.
Надежность экспериментальной системы также позволила авторам изучить несколько механистических аспектов пути, включая, например, определение роли фосфорилирования PARKIN с помощью PINK1 в нейронах, полученных из стволовых клеток.
«Мы хотим знать, как работают эти механизмы, потому что мы хотим иметь возможность использовать их для открытия лекарств или найти способы обойти вызывающие заболевание мутации у пациентов», - сказал Ордюро. «Теперь мы можем очень подробно проанализировать этот критический процесс в нейронных клетках и сделать это в масштабе одного эксперимента. При использовании предыдущих методов вам приходилось проводить десятки экспериментов, чтобы получить аналогичные или менее точные результаты».
Эффективность их нового метода теперь позволяет улучшить исследования пути PINK1-PARKIN и его роли в таких заболеваниях, как болезнь Паркинсона, как показано в этой работе для низкомолекулярных активаторов PINK1. По словам авторов, этот подход также может быть адаптирован для выявления механизмов дефектных путей в других системах и заболеваниях.
«Убиквитинирование - это основополагающий механизм, который клетки используют для удаления поврежденных или ненужных компонентов для поддержания своего здоровья и целостности», - сказал Харпер. «Это актуально не только для митохондрий, но и для удаления бактерий, белковых агрегатов и других органелл. Эту технологию можно использовать, чтобы пролить свет на биохимию многих различных систем».