Почти вся жизнь на Земле основана на копировании или репликации ДНК. Теперь впервые ученые смогли наблюдать за репликацией одной молекулы ДНК, сделав несколько удивительных открытий. Во-первых, случайностей в работе намного больше, чем предполагалось.
«Это другой взгляд на репликацию, который поднимает новые вопросы», - сказал Стивен Ковальчиковски, выдающийся профессор микробиологии и молекулярной генетики Калифорнийского университета в Дэвисе. Работа опубликована 15 июня в журнале Cell в соавторстве с Джеймсом Грэмом, научным сотрудником Калифорнийского университета в Дэвисе и Кеннетом Мариансом из онкологического центра Слоана Кеттеринга.
Используя сложную технологию обработки изображений и большое терпение, исследователи смогли наблюдать за репликацией ДНК бактерии E. coli и измерить, насколько быстро ферментный механизм работал на разных цепочках.
Основы репликации ДНК
Двойная спираль ДНК состоит из двух нитей, которые идут в противоположных направлениях. Каждая нить состоит из ряда оснований, A, T, C и G, которые образуют пары между цепочками: от A до T и от C до G.
Первым шагом в репликации является фермент под названием геликаза, который раскручивает и «расстегивает» двойную спираль на две одинарные нити. Фермент, называемый праймазой, прикрепляет «праймер» к каждой цепи, что позволяет начать репликацию, затем другой фермент, называемый ДНК-полимеразой, присоединяется к праймеру и движется вдоль цепи, добавляя новые «буквы», образуя новую двойную спираль.
Видеоиллюстрацию смотрите здесь:
Поскольку две цепи двойной спирали идут в противоположных направлениях, полимеразы работают по-разному на двух цепях. На одной цепи - «ведущей цепи» - полимераза может двигаться непрерывно, оставляя за собой след из новой двухцепочечной ДНК.
Но с другой, «отстающей нити», полимераза должна начать двигаться, прикрепляясь, производя короткий отрезок двухцепочечной ДНК, затем отсоединяясь и начиная снова. Принято считать, что полимеразы на лидирующей и отстающей цепях каким-то образом скоординированы, так что одна не опережает другую.
Эксперимент: катящиеся круги и флуоресцентный краситель
Для проведения эксперимента исследователи использовали круглый фрагмент ДНК, прикрепленный к предметному стеклу коротким хвостиком. По мере того, как механизм репликации вращается по кругу, хвост становится длиннее. Они могли включать и выключать репликацию, добавляя или удаляя химическое топливо (аденозинтрифосфат, АТФ), и использовали флуоресцентный краситель, который прикрепляется к двухцепочечной ДНК, чтобы подсветить растущие нити. Наконец, вся установка находится в проточной камере, поэтому нити ДНК растягиваются, как знамена на ветру.
Остановки, пуски и переменная скорость
Когда Грэм, Ковальчиковски и Марианс начали наблюдать за отдельными нитями ДНК, они заметили кое-что неожиданное. Репликация останавливается непредсказуемо, а при повторном запуске может менять скорость.
«Скорость может варьироваться примерно в десять раз», - сказал Ковальчиковски.
Иногда синтез отстающей нити останавливается, но лидирующая нить продолжает расти. Это проявляется как темная область на светящейся нити, потому что краситель не прилипает к одноцепочечной ДНК.
«Мы показали, что между нитями нет координации. Они полностью автономны», - сказал Ковальчиковски.
То, что выглядит как координация, на самом деле является результатом случайного процесса запуска, остановки и изменения скорости. Со временем любая одна прядь будет двигаться со средней скоростью; посмотрите на несколько нитей одновременно, и они будут иметь одинаковую среднюю скорость.
Ковальчиковски сравнил это с движением на автостраде.
"Иногда движение в переулке движется быстрее и обгоняет вас, а затем вы обгоняете его. Но если вы проедете достаточно далеко, вы окажетесь в одном и том же месте в одно и то же время."
Исследователи также обнаружили своего рода «ручку мертвеца» или автоматический тормоз на геликазе, который расстегивает ДНК раньше остальных ферментов. Когда полимераза останавливается, геликаза может продолжать движение, потенциально открывая брешь в раскрученной ДНК, которая может быть уязвима для повреждения. Фактически, незащищенная одноцепочечная ДНК подает сигнал тревоги внутри клетки, который активирует ферменты репарации.
Но оказывается, что когда он расцепляется и начинает убегать от остального репликационного комплекса, геликаза замедляется примерно в пять раз. Таким образом, он может пыхтеть, пока остальные ферменты не догонят его, а затем снова ускорятся.
Этот новый стохастический подход - это новый взгляд на репликацию ДНК и другие биохимические процессы, - сказал Ковальчиковски. «Это настоящий сдвиг парадигмы, и он подрывает многое из того, что написано в учебниках», - сказал он.