Нервную систему животного можно изучать, разрезая ее на тонкие слои, однако это неизбежно ведет к разрушению клеточных структур в ткани. Анализ сложных нервных связей тогда вряд ли возможен. Гораздо более элегантным методом является так называемая оптическая «очистка» различных тканей с помощью химических процессов, делающих животное прозрачным. Интересные структуры в ткани могут быть выборочно отмечены и проанализированы.
В Венском технологическом университете разработан метод очистки, который можно применять к насекомым, что является особенно сложной задачей. С помощью усовершенствованного светового микроскопа (так называемого ультрамикроскопа) теперь можно визуализировать большие образцы нервной ткани и делать снимки с высоким разрешением сложных нейронных сетей, которые были помечены флуоресцентными молекулами. Новый метод был опубликован в журнале Nature Communications.
Флуоресцентные молекулы
«Мы можем многое узнать о нервной системе животных, используя генную инженерию для введения специальных молекул в нервные ткани, которые затем можно заставить флуоресцировать», - говорит Марко Пенде, аспирант Технического университета Вены (Вена). Большой вопрос заключается в том, как можно визуализировать эти флуоресцентные молекулы, не повреждая ткани.
Одним из методов, который используется с большим успехом, является ультрамикроскопия. Прозрачная ткань освещается лазерным лучом, который расширяется специальными оптическими элементами, создавая двухмерную плоскую световую поверхность. Эта поверхность проникает в ткань и освещает те флуоресцентные молекулы, которые лежат именно в этой плоскости. Слой за слоем ткань можно анализировать с помощью этого светового листа, создавая трехмерную модель из двухмерных кадров на компьютере.
"Мы сосредоточились на плодовой мушке Drosophila melanogaster, потому что она представляет особый интерес для исследования нервной системы. К сожалению, особенно сложно разработать подходящий метод очистки от насекомых", - объясняет Марко Пенде. чтобы ткань стала прозрачной, ее нужно обрабатывать специальными химикатами, а в тканях насекомых эти химикаты до сих пор всегда разрушали флуоресцентные молекулы». Кроме того, ткани насекомых содержат хитин, который практически невозможно сделать прозрачным. Кроме того, глаза дрозофилы имеют особенно стойкий пигмент.
Команде TU Wien (Вена) совместно с Венским университетом и Медицинским университетом удалось найти способ сделать мух-дрозофил полностью прозрачными, не разрушая молекулы флуоресцентных маркеров. Это было достигнуто с помощью улучшенных химических смесей. «Это важный шаг вперед для исследовательского сообщества дрозофилы», - говорит профессор Томас Хаммель с кафедры нейробиологии Венского университета.
Снимки стали возможными благодаря новаторским оптическим исследованиям, проведенным Сайеде Сагафи (Технический университет Вены). Ей удалось значительно улучшить ультрамикроскоп: световой лист, которым плоскость освещается слой за слоем, был толщиной около 10 микрон. Усовершенствованный ультрамикроскоп теперь производит однородные световые листы толщиной всего 3 мкм на большой площади. Кроме того, микроскоп был оснащен дополнительной линзой, которая меняет точку фокусировки, подобно очкам: «До сих пор мы могли фокусироваться только на внешней области ткани, теперь мы можем снимать на сантиметровую глубину. загляните в ткань и все равно получите четкие изображения», - говорит профессор Ганс Ульрих Додт, заведующий кафедрой биоэлектроники (Технический университет Вены). «Это позволит получить впечатляющие изображения с высоким разрешением, которые дадут нам важную информацию о том, как работает нервная система дрозофилы."
Коннектом и поведение плодовой мухи
Новая методика теперь должна помочь в изучении так называемого «коннектома» дрозофилы. Коннектом - это расположение взаимосвязей по всей нервной системе, «схема электрической цепи» животного. Затем эту принципиальную схему можно связать с поведенческими паттернами дрозофилы.
Кроме того, дрозофила идеально подходит для анализа генов, которые приводят к нейродегенеративным заболеваниям у человека, таким как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Теперь прозрачные мушки дают уникальную возможность понять сложные изменения в различных областях нервной системы при нейродегенерации.