Светочувствительный белок солелюбивого серообразующего микроба оказался ключом к разработке методов, необходимых для передового открытия лекарств, понимания человеческого зрения и других биомедицинских приложений. В обзоре, опубликованном на этой неделе в журнале Structural Dynamics издательством AIP Publishing, физик Мариус Шмидт из Университета Висконсин-Милуоки представляет историю десятилетий исследований этого микроба и множество новых технологий, которые позволили использовать эти приложения.
В 1985 году исследователи обнаружили, что фиолетовая серная бактерия Halorhodospira halophila вырабатывает белок, чувствительный к синему свету, известный как фотоактивный желтый белок (PYP). Структурные изменения в изгибах и складках белка PYP действуют как сигналы, которые помогают бактериям реагировать на раздражители. Эти структурные изменения, сохраняющиеся во многих подобных белках, также необходимы для функционирования различных других белков, таких как пигмент родопсин, отвечающий за зрение в условиях слабого освещения в человеческом глазу.
При срабатывании вспышки синего света PYP претерпевает серию структурных изменений, которые происходят в течение миллисекунд, образуя по пути множество промежуточных структур. В течение почти трех десятилетий исследователи использовали такие методы, как спектроскопия и синхротронные измерения, для идентификации каждого промежуточного продукта, образующегося в течение этого крошечного временного интервала.
Возможность обнаружить эти промежуточные продукты реакции является важным шагом в разработке лекарств, потому что те же самые методы могут быть затем применены для изучения реакций, имеющих биомедицинское значение, объяснил Шмидт.
«Например, вы можете увидеть, как работает связанный с раком фермент, который катализирует определенную реакцию», - сказал он. «Каждая новая промежуточная структура, которую мы идентифицируем, может быть потенциальной мишенью для лекарства, чтобы манипулировать этой реакцией».
Однако, в отличие от этих других белков, PYP имеет небольшой размер и его легко производить в больших количествах, что делает его идеальным для экспериментальных исследований структуры белка. В 1995 году исследователи определили структуру белка PYP с помощью кристаллографии с разрешением 1,4 ангстрема - это примерно размер отдельных атомов. Сначала в большинстве исследований использовались подходы, основанные на спектроскопии, для понимания быстрых катализируемых светом структурных изменений в PYP.
Ранние структурные исследования полагались на синхротронные и синхротронные лучи, которые используют один импульс рентгеновского излучения, в качестве источников света для изучения белковых кристаллов. Эти эксперименты позволили получить дифракционные картины, чтобы выявить промежуточные продукты реакции, образовавшиеся всего через 100 пикосекунд, менее одной миллиардной доли секунды, после реакции до конца фотоцикла. Но наблюдение за более ранними временными точками было сложной технической задачей.
Первый временной ряд данных выявил промежуточные продукты в фазе реакции PYP от 100 наносекунд до 100 миллисекунд, но также поставил аналитическую задачу. Поскольку промежуточные соединения образуются и распадаются так быстро, образец в любой момент времени содержит смесь промежуточных структур. Как ученые могли отличить их друг от друга?
«До начала 2000-х, как распутать эту смесь, было нерешенной проблемой», - сказал Шмидт. «Но PYP предоставила первые наборы данных, из которых можно попытаться это сделать».
Решение было получено с помощью метода компонентного анализа, известного как разложение по сингулярным числам (SVD), который был применен к кристаллографии с временным разрешением Шмидтом и его коллегами.
«[SVD] можно удобно использовать для извлечения структуры чистых промежуточных соединений из смеси», - сказал Шмидт. «Этот метод действительно оказался центральным в анализе этих данных и наиболее часто применяемым на сегодняшний день».
До 2013 года исследователи выясняли фотоцикл PYP с разрешением 100 пикосекунд; более быстрая шкала времени оказалась неуловимой. Появление рентгеновского лазера на свободных электронах (XFEL), нового источника света, помогло решить эту проблему. Используя анализ XFEL и SVD, исследователи также выявили более ранние процессы, выявив фундаментальные, решающие этапы цис- и транс-изомеризации PYP в фемтосекундных и пикосекундных временных масштабах..
Подобные реакции, которые необходимы для человеческого зрения, также происходят, когда свет попадает на пигмент родопсина сетчатки. «Было бы очень интересно увидеть, как эта изомеризация происходит в режиме реального времени с использованием XFEL», - сказал Шмидт. «Если мы сможем увидеть это в PYP, мы, возможно, сможем визуализировать это и в родопсине. PYP оказался образцом для подражания для других реакций, которые характеризуются цис-транс-изомеризацией».