Инструмент, использующий свет для управления веществом внутри живых клеток, начал объяснять, как белки собираются в различные жидкие и гелеобразные твердые состояния, что является ключом к пониманию многих критических клеточных операций.
Чудеса сложности, в клетках происходят многие тысячи одновременных химических реакций. Некоторые реакции происходят внутри специализированных отсеков, называемых органеллами. Однако у некоторых органелл отсутствует какая-либо мембрана, которая отделяла бы их от остального вещества, плавающего внутри клеток. Эти безмембранные органеллы каким-то образом сохраняются как автономные структуры среди клеточного моря воды, белков, нуклеиновых кислот и других молекул.
Ученые из Принстонского университета разработали новый инструмент, получивший название optoDroplet, который предлагает беспрецедентный доступ к манипулированию и пониманию химии, которая позволяет функционировать безмембранным органеллам.
«Этот инструмент optoDroplet позволяет нам анализировать законы физики и химии, которые управляют самосборкой безмембранных органелл», - сказал Клиффорд Брангвинн, доцент кафедры химической и биологической инженерии в Принстоне и старший автор. из статьи, опубликованной онлайн в Cell 29 декабря. «Основные механизмы, лежащие в основе этого процесса, очень плохо изучены, и если мы сможем справиться с этим, может появиться надежда на разработку вмешательств и методов лечения разрушительных заболеваний, связанных с агрегацией белков., такие как БАС."
Предыдущие исследования показали, что безмембранные органеллы собираются внутри клетки в процессе, известном как фазовый переход: примеры известных фазовых переходов включают конденсацию водяного пара в капельки росы или замерзание жидкой воды в твердый лед. Исследования, проведенные Брангвином и его коллегами за последние несколько лет, показали, что изменение концентрации определенных белков или изменение их структуры, по-видимому, вызывает фазовый переход, который позволяет белкам конденсироваться в каплеобразные органеллы.
На сегодняшний день, однако, в большинстве исследований использовались очищенные белки, изученные в пробирках, и у исследователей было мало методов для изучения фазовых переходов в неистовых динамо-машинах, которыми являются живые клетки. OptoDroplets поможет ученым узнать, когда фазовые переходы идут неправильно, образуя твердые гели и кристаллические агрегаты белков, вызывающих заболевания, включая болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз (БАС).
OptoDroplet опирается на метод, называемый оптогенетикой, с участием белков, поведение которых можно изменить под воздействием света. (Клетки в основном состоят из воды и поэтому практически прозрачны.) Исследователи показали, что они могут вызывать фазовые переходы и создавать безмембранные органеллы, включая активируемые светом белки. Они также могли отменить переходы, просто выключив свет. Увеличение интенсивности света и концентрации белка позволило исследователям дополнительно контролировать переход. Изменяя эти входные данные, они могут определить, когда образуются конденсированные жидкие белковые капли, а также твердые белковые агрегаты, которые, возможно, связаны с заболеваниями.
«OptoDroplet предоставляет нам уровень контроля, который мы можем использовать для точного отображения того, что мы называем фазовой диаграммой в живых клетках», - сказал Брэнгвинн. «Благодаря этому мы начинаем понимать, как клетки используют свои естественные механизмы для перемещения по этой внутриклеточной фазовой диаграмме для сборки различных типов органелл».
Ведущий автор статьи - Ёндэ Шин, научный сотрудник группы Soft Living Matter компании Brangwynne, входящей в состав Принстонского факультета химической и биологической инженерии. Соавторы Джоэл Берри и Микко Хаатаджа из Департамента машиностроения и аэрокосмической техники помогли разработать математические модели для понимания внутриклеточного фазового поведения, а Николь Паннуччи и Джаред Тотчер из Департамента молекулярной биологии являются экспертами в области оптогенетики и помогли разработать молекулярный дизайн белков оптокапель. Работа частично поддержана Национальным институтом здравоохранения и Национальным научным фондом.
Используя клетки мыши и человека, исследовательская группа сплайсировала ген светочувствительного белка из растения под названием кресс-салат (или Arabidopsis thaliana), родственника капусты и горчицы, который является основой генетическое исследование. Воздействие синего света заставляет белок самоассоциироваться, сжимаясь сам по себе.
Светочувствительная метка была слита с белковыми компонентами, которые, как считается, управляют фазовыми переходами в живых клетках. Используя свет, исследователи обнаружили, что они могут заставить белки слипаться, имитируя процесс конденсации, который естественным образом происходит в клетках. «Если использовать аналогию с водяным паром, вы можете представить, что мы использовали лазер для локального изменения температуры некоторой области воздуха, чтобы из нее конденсировались капли воды», - сказал Брэнгвинн..
Команда неоднократно заставляла белки конденсироваться, а затем растворяться, включая и выключая свет. Процесс оказался полностью обратимым даже после многих циклов. Однако при ярком свете или высоких концентрациях белков исследователи создали полутвердые гели. Первоначально эти гели были обратимыми, но со временем они затвердевали, образуя необратимые комковатые агрегаты, подобные тем, которые обнаруживаются при некоторых заболеваниях.
«С помощью optoDroplet мы показали, что можем легко собирать и разбирать жидкости с фазовым разделением, и они, по-видимому, не вызывают никаких проблем для клетки», - сказал Брэнгвинн. «Но гелеобразные агрегаты кажутся более проблематичными, поскольку в течение многих циклов они превращаются в стойкие агрегаты, с которыми клетка больше не может иметь дело и которые могут начать разрушать здоровые биологические процессы».
Одним из примеров является белок под названием FUS. Белок FUS имеет решающее значение для работы клетки; он помогает производить другие белки и восстанавливать поврежденную ДНК. Но десятки генетических мутаций могут привести к тому, что белок FUS станет слишком липким, что приведет к БАС, также известному как болезнь Лу Герига. Неврологическое состояние, при котором пациенты теряют способность произвольно контролировать свои мышцы, БАС характеризуется скоплением белков в нервных клетках. Эти скопления могут возникать из-за патологической агрегации FUS или других белков, а не оставаться в виде динамических капель жидкости. Болезнь Гентингтона и болезнь Альцгеймера также связаны с скоплением белков, закупоривающих клетки, что еще раз указывает на то, что аномальные фазовые переходы в клетках тесно связаны с этими состояниями.
Эдвард Лемке, исследователь из Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия, который не участвовал в исследовании клеток, отметил перспективность optoDroplet.
«Белки, на которые нацелен optoDroplet, являются важным компонентом белков, разделяющих фазы, многие из которых также связаны с печально известными заболеваниями», - сказал Лемке. «Система optoDroplet дает доступ к модулированию состояния этих белков внутри клетки минимально инвазивным и строго контролируемым образом, поэтому она может дать новое представление о том, как они выполняют свою функцию."
Брэнгвинн и его коллеги с нетерпением ждут продолжения экспериментов с optoDroplet, чтобы лучше понять сложное поведение клеток.
«Это фундаментальная наука, которой мы занимаемся, отвечая на основные вопросы о фазовых переходах в клетках», - сказал Брэнгвинн. «Но мы надеемся, что эти идеи раскроют не только то, как работают здоровые клетки, но и то, как они могут заболеть и, возможно, в конечном итоге вылечиться».