В будущем можно будет гораздо эффективнее проводить испытания новых препаратов на бактериях с помощью микрофлюидных устройств, поскольку каждая из сотен и тысяч капель, движущихся по микроканалам, может выступать в роли отдельных инкубаторов. Однако до сих пор не существовало быстрого или точного метода оценки условий содержания кислорода в отдельных микрокаплях. Это ключевое препятствие удалось преодолеть в Институте физической химии Польской академии наук.
Ни в рядах больших промышленных резервуаров, ни на полках, заставленных пробирками и химическими стаканами. Будущее химии и биологии едва видно глазу: это сотни и тысячи микрокапель, несущихся по тонким трубочкам микрожидкостных устройств. Идет гонка за поиском технологий, которые позволят проводить контролируемые химические и биологические эксперименты в микрокаплях. В Институте физической химии Польской академии наук (IPC PAS) в Варшаве впервые был продемонстрирован метод дистанционной, но быстрой и точной оценки потребления кислорода микроорганизмами, живущими в отдельных микрокаплях.
"Устройства для культивирования бактерий в микрокаплях имеют шанс революционизировать работу по разработке новых антибиотиков и изучению механизмов, отвечающих за приобретение бактериями лекарственной устойчивости. В одной небольшой микрожидкостной системе можно вмещать несколько сотен или даже несколько тысяч микрокапель - и проводить в каждой из них разные эксперименты, например, с разными видами микроорганизмов и при разных концентрациях антибиотика в каждой капле», - описывает проф. Затем Петр Гарстецки (IPC PAS) поясняет: «Чтобы такие исследования были возможны, необходимо обеспечить бактериям условия для развития хотя бы на несколько недель. Таким образом, знание о притоке кислорода к каплям и скорости его потребление микроорганизмами становится чрезвычайно важным. В нашей последней системе мы демонстрируем, как читать эту ключевую информацию."
Биореакторы будущего представляют собой капли воды с питательной средой, взвешенной в жидкости-носителе, с которой они не смешиваются (обычно это масло). В канале микрофлюидного устройства каждая капля длиннее своей ширины и почти полностью заполняет его просвет; подобранные таким образом размеры обеспечивают то, что капли не меняются местами в канале и на протяжении всего эксперимента их можно без проблем идентифицировать. В то же время между каждой микрокаплей и стенкой канала должен постоянно поддерживаться тонкий слой масла. Без этого бактерии находились бы в непосредственном контакте со стенками канала, чтобы иметь возможность оседать на них и переходить из капли в каплю. К сожалению, когда микрокапля неподвижна, со временем она выталкивает масло, отделяющее ее от стенок, открывая ее для загрязнения. По этой причине капли должны находиться в постоянном движении - даже в течение нескольких недель.
Растущим бактериям нужна питательная среда, а продукты жизнедеятельности должны удаляться из окружающей среды с соответствующей скоростью. Поэтому информация о потреблении кислорода бактериями в отдельных каплях имеет решающее значение для работы микробиореакторов.
Сразу видно, в чем проблема. В каждой из сотен движущихся капель измерения нужно проводить с частотой, соответствующей частоте деления бактерий или более, на практике не реже одного раза в 15 минут. Кроме того, измерение не может вызвать каких-либо помех в микрокаплях», - говорит аспирант Михал Хорка (IPC PAS), соавтор публикации в журнале Analytical Chemistry.
На помощь варшавским исследователям пришли химики из Австрийского института аналитической химии и пищевой химии Технологического университета Граца. Ими были получены полимерные наночастицы с фосфоресцирующим красителем, которые после возбуждения излучают свет тем дольше, чем выше концентрация кислорода в окружающем растворе (наночастицы прошли испытания в ИПЦ ПАН на бактериях с целью определения их возможной токсичности - не обнаружено).
Исследования по мониторингу потребления кислорода в каплях начались с приготовления водного раствора с бактериями, питательной средой и подходящим количеством наночастиц. Смесь вводили в микрожидкостную систему, состоящую из трубок с тефлоновыми соединителями и каналами соответствующей формы. Первый модуль образовывал капли объемом ок. 4 мкл, которые были направлены в инкубационную пробирку, намотанную на катушку. Посередине его длины находился еще один модуль с детекторами для измерения кислорода и поглощения.
В инкубационной части в одной фазе цикла капли текли в одном направлении, во второй - в другом, управляемом электроникой с помощью подходящих электромагнитных клапанов. Все это выглядит достаточно просто, но на практике одной из самых сложных задач было обеспечить плавный переход между модулем детектирования и трубкой, чтобы не происходило бактериальное загрязнение в местах соединений», - объясняет аспирант Горка.
При прохождении через модуль детекции капли проходили под оптическим датчиком, который измерял так называемую оптическую плотность, которая является стандартным параметром, используемым для оценки количества клеток (чем больше бактерий в каплях, тем меньше через них проходит свет). В свою очередь измерение продолжительности фосфоресценции наночастиц, оценивая концентрацию кислорода в микрокаплях, проводили с помощью оптического детектора Piccolo2, предоставленного австрийской группой. Этот детектор, похожий на большую флешку, был подключен напрямую к USB-порту управляющего компьютера. Сравнив информацию с обоих датчиков, исследователи IPC PAS показали, что сконструированное ими микрожидкостное устройство позволяет регулярно и быстро отслеживать метаболическую активность бактерий в отдельных микрокаплях.
Мы проводили наши тесты как с бактериями, плавающими в воде поодиночке - так ведут себя обычные бактерии Escherichia coli, так и с бактериями, имеющими тенденцию слипаться в комки - как в случае с бациллами туберкулеза. или другие, принадлежащие к тому же семейству, включая изученные нами Mycobacterium smegmatis. Оценка скорости потребления кислорода обоими видами микроорганизмов оказалась не только возможной, но и надежной», - подчеркивает аспирант Артур Рущак (ИПЦ ПАН).
Результаты исследования, финансируемого Европейским стартовым грантом ERC (польская сторона) и грантом Марии Склодовской-Кюри (австрийская сторона), являются важным шагом в процессе создания полнофункциональных микрожидкостных устройств для проведения биологических экспериментов. длящийся много недель. Несколько лет назад в ИПЦ ПАН была разработана система для культивирования бактерий в микрокаплях, однако она была сконструирована на поликарбонатной пластине. Максимальные размеры пластины не превышали 10 см, что сильно ограничивало количество капель; кроме того, в результате взаимодействия с поликарбонатом через четыре дня каналы были заражены бактериями. Устройства из тефлоновых модулей и трубок лишены этих недостатков и подходят для практического применения.