Исследователи из Объединенного института биоэнергетики Министерства энергетики США (JBEI) и Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли (Berkeley Lab) обнаружили новый фермент, который позволит микробам производить возобновляемую альтернативу толуолу на основе нефти, широко используемому октанового числа в бензине, мировой рынок которого составляет 29 миллионов тонн в год.
Результаты исследования под руководством Гарри Беллера, старшего научного сотрудника лаборатории Беркли и научного руководителя JBEI, были опубликованы в понедельник в журнале Nature Chemical Biology. Другими ведущими соавторами являются Андрия Родригес и Камрун Заргар из JBEI.
Основным направлением исследований в JBEI и в более широком сообществе исследователей биотоплива является производство промышленно и коммерчески значимых видов топлива и химикатов из возобновляемых ресурсов, таких как лигноцеллюлозная биомасса, а не из нефти. Фермент, обнаруженный в ходе этого исследования, впервые позволит микроорганизмам производить толуол на биологической основе и, по сути, первое микробиологическое производство любого ароматического углеводородного биотоплива.
Фермент был открыт в результате интенсивного изучения двух очень разных микробных сообществ, производящих толуол. Одно сообщество содержало микробы из озерного осадка, а другое - из осадка сточных вод. Поскольку микробы в окружающей среде являются резервуаром ферментов, которые катализируют необычайно разнообразные химические реакции, ученые, работающие в области биотехнологии, нередко берут ферменты из природы.
Beller был мотивирован исследовать толуол на биологической основе после прочтения литературных отчетов 1980-х годов, которые выявили микробный биосинтез толуола в отложениях бескислородных озер. Несмотря на ряд сообщений о бактериальном производстве толуола с того времени, идентичность фермента, катализирующего эту биохимически сложную реакцию, десятилетиями оставалась загадкой.
Толуол-синтезирующий фермент, обнаруженный в этом исследовании, фенилацетатдекарбоксилаза, принадлежит к семейству ферментов, известных как глицилрадикальные ферменты (GRE). Ученые начали распознавать GRE только в 1980-х годах, а фенилацетатдекарбоксилаза - всего лишь восьмой известный тип реакции GRE, который был обнаружен и охарактеризован с тех пор. Однако метагеномные данные, представленные в исследовании JBEI и других, указывают на тот факт, что в природе существует гораздо больше GRE, которые еще предстоит охарактеризовать.
Радикальная природа GRE позволяет им катализировать химически сложные реакции, такие как анаэробное декарбоксилирование фенилацетата с образованием толуола. Помимо их потенциального биотехнологического применения, ряд известных GRE имеют отношение к здоровью человека и встречаются в микробиоме кишечника человека.
Процесс открытия ферментов для этого проекта был сложным и нестандартным. Исследователи сначала начали работать с видами бактерий, которые, как сообщается, производят толуол, но когда эти сообщения оказались невоспроизводимыми, ученые обратились к окружающей среде в поисках культур, продуцирующих толуол, в частности, к муниципальным сточным водам и бескислородным отложениям озер.
«Все проекты по открытию ферментов сложны. Но перейти от открытия одного вида бактерий к открытию сложного микробного сообщества из осадка сточных вод или озерных отложений было на порядки сложнее», - говорит Беллер. «Это исследование превратилось в поиск иголки в стоге сена фермента, продуцирующего толуол, в пуле кандидатов из сотен тысяч ферментов».
На самом деле, анализ метагенома показал, что каждое из этих микробных сообществ содержит более 300 000 генов, что эквивалентно более чем 50 бактериальным геномам. Еще одна проблема заключалась в том, что анаэробные микробные сообщества и многие из их ферментов были чувствительны к кислороду, что вынуждало ученых манипулировать культурами и ферментами в строго анаэробных условиях.
Процесс открытия объединил методы очистки белков, используемые биохимиками на протяжении десятилетий, такие как быстрая белковая жидкостная хроматография, с современными метагеномными, метапротеомными и связанными с ними биоинформационными анализами, некоторые из которых были проведены в сотрудничестве с Объединенным институтом генома, DOE Office of Science User Facility. Важным компонентом процесса открытия было подтверждение предсказаний исследователей о ферменте биосинтеза толуола с помощью экспериментов с использованием строго контролируемых анализов с использованием очищенных белков..
В результате этого исследования возникает интригующий вопрос: почему бактерия производит толуол? У исследователей нет окончательного ответа, но в статье представлены две гипотезы. Одна из возможностей состоит в том, что бактерия вырабатывает толуол в качестве токсина, чтобы превзойти другие микробы в окружающей среде. Другая гипотеза состоит в том, что реакция фенилацетатдекарбоксилазы (продуцирующей толуол) обеспечивает бактериям стратегию регулирования своего внутреннего pH в несколько кислой ферментирующей среде.
Беллер и его коллеги считают, что результаты их исследования имеют значение для фундаментальной и прикладной науки. С биохимической точки зрения исследование расширяет известный каталитический диапазон GRE, а с биотехнологической точки зрения оно позволит осуществить первый биохимический синтез ароматического топливного углеводорода из возобновляемых ресурсов.
«Нам так много предстоит узнать о необычайном метаболическом разнообразии бактерий», - сказал Беллер. «На протяжении эпох эволюции природа изобрела ферменты, которые могут катализировать сложные химические реакции, и когда мы их обнаружим, мы сможем использовать их в биотехнологии».
JBEI - это исследовательский центр Министерства энергетики США по биоэнергетике, финансируемый Управлением науки Министерства энергетики США. Другими соавторами статьи «Открытие ферментов для синтеза толуола из бескислородных микробных сообществ» являются Ю-Вей Ву, Авниш К. Саини, Рене М. Сэвилл, Хосе Х. Перейра, Пол Д. Адамс, Сюзанна Г. Триндж, Кристофер Дж. Петцольд и Джей Д. Кислинг.