Прерванные некодирующие области в пре-мРНК, называемые «интронами», вырезаются путем «сплайсинга» с образованием зрелых кодирующих мРНК, которые транслируются в белки. Поскольку интроны пре-мРНК человека различаются по длине, механизмы сплайсинга и задействованные факторы, вероятно, не универсальны. В исследовании, проведенном учеными из Университета здоровья Фудзита в Японии, сообщается о подмножестве коротких интронов человека, которые сплайсируются новым существенным фактором сплайсинга, SPF45 (RBM17), вместо известного фактора сплайсинга, димера U2AF.
Гены, кодирующие белок, несут в себе схему производства белка. Однако у высших организмов большинство транскриптов кодирующих генов, или пре-мРНК, разделены некодирующими последовательностями, называемыми «интронами», которые необходимо вырезать или «сплайсировать» для получения зрелой мРНК, которая может транслироваться в белок..
Интроны пре-мРНК человека сильно различаются по своей длине: от менее пятидесяти до более миллиона нуклеотидов (нт). Сплайсинг пре-мРНК человека включает динамические ступенчатые реакции в огромном комплексе белок-РНК, называемом «сплайсосомой», который включает пять видов малых ядерных рибонуклеопротеинов, называемых U-мяРНП, и множество белковых факторов. Основные сигнальные последовательности сплайсинга в пре-мРНК - 5'-сайт сплайсинга, последовательность сайта ветвления и полипиримидиновый тракт (ППТ), за которым следует 3'-сайт сплайсинга, - связаны факторами сплайсинга U1 snRNP, U2 snRNP. и U2AF65/U2AF35 соответственно, которые вместе составляют сплайсосомный комплекс А. Глобулярная форма комплекса А полностью занимает длину одноцепочечной РНК длиной 79-125 н., что примерно в два раза больше длины известных коротких интронов (43-56 н.). Каким образом эти короткие интроны способны приспособиться к негабаритному комплексу с известными эссенциальными факторами? Можно предположить, что такие короткие интроны сплайсируются альтернативными механизмами.
Теперь группа исследователей во главе с профессором Акилой Маеда из Института комплексных медицинских наук Университета здоровья Фудзита, Япония, попыталась ответить на этот вопрос в своем последнем исследовании, опубликованном в Nature Communications. Развивая свои выводы, соавтор статьи Казухиро Фукумура говорит: «Варьирование длины интронов пре-мРНК человека обширно, от пятидесяти до более миллиона нуклеотидов. Таким образом, мы постулируем, что, возможно, существует отдельный альтернативный механизм сплайсинга, участвующий в сплайсинге. коротких интронов человека."
Команда начала с поиска основных факторов, необходимых для сплайсинга коротких интронов человека из 154 ядерных белков человека. Они подавляли экспрессию этих белков в клеточной линии человека (клетки HeLa) с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК). Для анализа активности сплайсинга они выбрали пре-мРНК HNRNPH1 (гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H1), включая короткий интрон из 56 нуклеотидов.
Самая сильная репрессия сплайсинга в пре-мРНК HNRNPH1 с интроном длиной 56 нуклеотидов была вызвана нокдауном SPF45, но в пре-мРНК с контрольным интроном длиной 366 нуклеотидов репрессии сплайсинга не наблюдалось. Чтобы дополнительно подтвердить, что SPF45 является общим фактором сплайсинга для группы коротких интронов, они выполнили секвенирование всего транскриптома с РНК, полученной из клеток с нокдауном SPF45. Наиболее частыми изменениями сплайсинга в клетках с нокдауном SPF45 были сохранение интронов, и было идентифицировано 187 сохраненных интронов. Примечательно, что распределение длин этих зависимых от SPF45 интронов было сильно смещено в сторону более коротких длин. Это предполагает, что SPF45 необходим для сплайсинга многих пре-мРНК с короткими интронами.
Далее исследователи исследовали фактор, определяющий SPF45-зависимость некоторых коротких интронов. Последовательность РРТ и расположенный ниже 3'-сайт сплайсинга необходимы для связывания известного аутентичного гетеродимера фактора сплайсинга U2AF (U2AF65/U2AF35). Примечательно, что усечение в этом PPT привело к зависимости от SPF45, что позволяет предположить, что короткий PPT имеет решающее значение для зависимого от SPF45 сплайсинга. Как и ожидалось, нокдаун гетеродимера U2AF значительно снижал сплайсинг обычных интронов; Зависимые от SPF45 короткие интроны, однако, были сплайсированы довольно эффективно, что позволяет предположить, что SPF45 вытесняет гетеродимер U2AF на укороченных PPT, а недавно установленный SPF45 способствует сплайсингу коротких интронов. Наконец, биохимический анализ и анализы сплайсинга с различными мутантными белками SPF45 помогли создать модель SPF45-зависимого сплайсинга на коротком интроне с укороченным PPT..
Ранее сообщалось, что SPF45 действует как регулятор альтернативного сплайсинга; однако SPF45 также является важным фактором выживания и поддержания клеток in vivo. Исследовательская группа предлагает решение этой загадки, продемонстрировав, что SPF45 является новым и отличным конститутивным фактором сплайсинга в ранней сплайсосоме, т.е.т. е. подмножество коротких интронов человека с укороченными PPT сплайсируется с SPF45, но не с ранее известным аутентичным гетеродимером U2AF.
проф. Майеда заявляет: «Это новаторское достижение с точки зрения фундаментальных исследований, однако применение наших результатов также потенциально интригует. Сверхэкспрессия SPF45 придает множественную лекарственную устойчивость к противоопухолевым препаратам. Предположительно, гены, участвующие в этом механизме, содержат SPF45-. зависимых интронов. Таким образом, избыточная экспрессия SPF45 может вызывать повышенную регуляцию таких генов за счет активации сплайсинга транскриптов. Понимание этих механизмов может помочь в разработке эффективных терапевтических вмешательств».