Архитекторы не могут построить дом без надлежащих размеров фундамента. Точно так же ученые не могут разработать целенаправленную лекарственную терапию без предварительного измерения поверхности биомолекул, таких как белки, РНК или ДНК.
Наилучшая практика для сбора этих измерений горячо оспаривается в области биофизики и структурной биологии, потому что ученые предпочитают разные, персонализированные методы, которые часто дают различные результаты для одной и той же биомолекулы.
В гонке к финишу команда из 27 лабораторий по всему миру, включая лабораторию Хьюго Санабриа «Биофизика одной молекулы» в Университете Клемсона, решила устранить это несоответствие. Их выводы, опубликованные на этой неделе в журнале Nature Methods, позволили разработать стандартизованный протокол для резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET), возможно, одного из самых точных методов измерения расстояний внутри биомолекул.
В FRET два хромофора или светочувствительные химические соединения присоединены к биомолекуле в двух разных положениях. Когда хромофоры падают близко друг к другу и располагаются в правильной ориентации, происходит передача энергии от одного хромофора в возбужденном состоянии - донора - к другому хромофору - акцептору. После включения теории Фёрстера, описывающей процесс передачи энергии между двумя хромофорами, расстояние между ними можно зафиксировать под микроскопом. Последующее измерение называется эффективностью FRET и широко известно как «спектроскопическая линейка».
«Вы можете определить расстояние между хромофорами двумя способами, используя измерения на основе интенсивности», - сказал Санабрия.«Один из способов заключается в том, что вы фиксируете свой образец на покровном стекле микроскопа и смотрите на эту молекулу в течение стандартного периода времени. Это исследования иммобилизации. Другой метод заключается в том, что молекулы перемещаются, поэтому они свободны. для диффузии, и вы отбираете множество отдельных молекул в течение многих коротких периодов времени. При этом используется конфокальный микроскоп, подобный тому, который мы построили в Клемсоне».
Идея объединить две методологии возникла в 2012 году на конференции в Германии, где исследователи из сообщества одиночных молекул инициировали глобальное сравнительное исследование для определения эффективности FRET.
В ходе исследования участвующим исследователям было отправлено по два набора молекул двухцепочечной ДНК, которые были помечены хромофорами FRET в разных положениях. Одни исследователи измеряли молекулы методом иммобилизации, другие - методом диффузии. Однако под видом слепого исследования ни один из исследователей не знал фактического расстояния между хромофорами, что вызвало проблему в том, кто может провести наиболее точное измерение экспериментально.
К счастью для Санабрии, нового доцента на кафедре физики и астрономии Клемсона, когда исследование было начато, его лаборатория оказалась в пределах общей ошибки.
«Когда я сравнил наши результаты с другими результатами, которые представили люди, мы оказались среди тех, кто ближе всего отошел от ожидаемого. Для нас это было фантастически», - сказал Санабрия. «Это был один из первых образцов, которые мы измерили здесь, в Клемсоне, и для меня это стало подтверждением того, что «да, мы делаем это правильно».
В конце концов, исследователи сообщили о своих выводах с разницей в семь процентов друг от друга, придя к соглашению о наборе процедур, которые позволяют проверять точную и точную эффективность FRET независимо от того, какой метод используется.
«Это устанавливает эти две методологии в качестве стандартов в FRET», - сказал Санабрия. «Это в основном устанавливает, что если вы делаете это по-своему, с вами все в порядке, если вы следуете набору правил. Теперь новые исследователи, желающие провести FRET, имеют в своем распоряжении эти стандарты. Они могут купить образцы у поставщика, измерить их, и если они получат этот известный номер, они готовы к работе».
С этим исследованием приходит расширенный набор возможностей структурной биологии для измерения молекул различных форм и размеров и создания новых структурных моделей этих молекул. И FRET, говорит Санабрия, является единственным методом, который может преодолеть ограничения размера и стабильности, с которыми сталкиваются «золотые стандарты структурной биологии», такие как рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс и криоэлектронная микроскопия.
«После того, как у вас есть структура, вы можете заняться тем, что называется целевой разработкой лекарств», - сказал Санабрия. «Вы можете проводить исследования in silico, когда вы обращаетесь к базам данных этих малых молекул и смотрите, какие молекулы взаимодействуют с этой ДНК, РНК или белком, и каковы будут эффекты этой маленькой молекулы. Это может привести к потенциальным новым лекарствам или применению лекарств от других болезней, которые мы не рассматривали».
Являясь пионерами методологии FRET, Санабрия и его коллеги в сообществе одиночных молекул работают над размещением структурных моделей биомолекул, обнаруженных с помощью FRET, в общедоступную базу данных, чтобы заинтересованные исследователи могли продолжить свои исследования в области структурной биологии.
"Сейчас то, что мы делаем, находится на переднем крае науки. Это действительно открывает новую область в биофизике", - сказал он.