Исследователи Университета Осаки разрабатывают методы определения рН in vivo и выясняют явления, вызывающие экспорт белка в биологической активности.
Бактериальные клеточные мембраны выпячиваются, образуя жгутики, которые состоят примерно из 30 различных белков и необходимы для подвижности. Бактериальные жгутиковые аппараты экспорта типа III используют энергию, полученную в результате гидролиза АТФ, и протонно-движущую силу (PMF) через клеточную мембрану для перемещения жгутиковых белков через мембрану. Предыдущие исследования показали, что жгутиковые трансмембранные экспортные ворота играют решающую роль в передаче энергии для развертывания и транспорта жгутиковых белков для построения жгутиков с помощью PMF. Однако механизмы преобразования энергии до конца не изучены.
Теперь, разработав систему визуализации высокого разрешения с высоким пространственным и pH-разрешением, исследователи Университета Осаки успешно сопоставили уровни pH с внутриклеточной локализацией. Они использовали оптическую микроскопию на основе флуоресценции с системой освещения с двумя длинами волн и камерой устройства с зарядовой связью, умножающей электроны, для обнаружения присутствия флуоресцентного белкового зонда pHluorin. Рационометрический pH-зонд pHluorin был модифицирован мутацией M153R для повышения яркости и стабильности и использовался для измерения pH микросреды, окружающей зонд, в диапазоне от 5,5 до 8,5 при соотношении интенсивностей эмиссии 410/470. Цель состояла в том, чтобы охарактеризовать роль, которую играют АТФ и протоны (Н+) в экспорте жгутиковых белков у сальмонелл. Об исследовании недавно сообщалось в mBio.
Интересно, что исследователи отметили небольшие, но значимые различия внутриклеточного pH. «Мы обнаружили самые высокие уровни pH в плазматических мембранах, промежуточные уровни в экспортных воротах и самые низкие уровни в оставшейся цитоплазме. Соответственно, мы предполагаем, что аппарат экспорта использует как гидролиз АТФ, так и дифференциацию H + для достижения экспорта белка», - исследование, соответствующее говорит автор Кэйити Намба.
Важно, это исследование предполагает, что комплекс цитоплазматической АТФазы FliH12FliI6FliJ и экспортные ворота работают согласованно, чтобы управлять потоком H+ внутрь через ворота, опосредованным АТФазой Flil, а также инициировать экспорт белка наружу. Таким образом, он устанавливает, что визуализация pH обеспечивает реалистичное окно для объяснения клеточных ответов и передачи сигналов в контексте передачи энергии.
Это исследование представляет собой важный шаг к описанию механизмов, лежащих в основе сложного процесса преобразования энергии. Поскольку поддержание внутриклеточного гомеостаза pH имеет жизненно важное значение для функциональных клеточных реакций, чувствительная и точная визуализация pH в живых организмах приобрела важное значение в медицине и фармакологии.
Намба считает эту методологию значительным достижением: «Наши результаты показывают, что зонды pHluorin представляют собой интересный класс зондов pH с многофункциональным применением в различных областях биологии и фармацевтики».