Используя технологию секвенирования ДНК с нанопорами, исследователи из Технического университета Делфта и Университета Иллинойса смогли просканировать один белок: медленно перемещая линеаризованный белок через крошечную нанопору, по одной аминокислоте в то время, исследователи смогли считывать электрические токи, которые относятся к информационному содержанию белка. Сегодня исследователи опубликовали доказательство своей концепции в журнале Science. Новый одномолекулярный пептидный считыватель знаменует собой прорыв в идентификации белков и открывает путь к секвенированию одиночных молекул и каталогизации белков внутри одной клетки.
Белки – это рабочие лошадки наших клеток, но мы просто не знаем, какие белки носим с собой. Белок представляет собой длинную пептидную цепочку, состоящую из 20 различных типов аминокислот, сравнимую с ожерельем из различных видов бусин. По схеме ДНК мы можем предсказать, из каких аминокислот состоит белок. Однако конечный белок может сильно отличаться от проекта, например, из-за посттрансляционных модификаций. Современные методы измерения белков дороги, ограничены большими объемами и не могут обнаружить многие редкие белки. Благодаря технологии на основе нанопор уже можно сканировать и секвенировать отдельные молекулы ДНК. Команда под руководством Сеса Деккера (Технический университет Делфта) адаптировала этот метод для сканирования одного белка по одной аминокислоте за раз.
«За последние 30 лет секвенирование ДНК на основе нанопор превратилось из идеи в реально работающее устройство», - объясняет Сис Деккер. «Это даже привело к коммерческим ручным секвенаторам нанопор, которые обслуживают рынок геномики с оборотом в миллиарды долларов. В нашей статье мы расширяем эту концепцию нанопор для чтения отдельных белков. Это может оказать большое влияние на фундаментальные исследования белков и медицинскую диагностику».
Как бусы на ветер
Новая методика выявляет характеристики даже отдельных аминокислот внутри пептида, но как? Ведущий автор статьи Генри Бринкерхофф, начавший эту работу в качестве постдока в лаборатории Деккера, объясняет: «Представьте себе цепочку аминокислот в одной пептидной молекуле в виде ожерелья с бусинами разного размера. Затем представьте, что вы открываете кран, когда вы медленно перемещаете это ожерелье в канализацию, которая в данном случае является нанопорой. Если большая бусина блокирует слив, вода будет течь только струйкой; если у вас есть более мелкие бусины в ожерелье прямо в канализации, больше вода может протекать. С нашей техникой мы можем очень точно измерить количество протекающей воды (фактически ионный ток)». Сиз Деккер с энтузиазмом добавляет: «Крутая особенность нашей методики заключается в том, что мы могли считывать одну пептидную цепочку снова и снова: затем мы усредняем все считывания этой одной молекулы и, таким образом, идентифицируем молекулу практически со 100% точностью."
Это приводит к уникальному считыванию, характерному для конкретного белка. Когда исследователи изменили даже одну-единственную аминокислоту в пептиде («одна бусина в ожерелье»), они получили очень разные сигналы, что указывает на чрезвычайную чувствительность метода. Группа под руководством Алека Аксиментьева из Университета Иллинойса выполнила молекулярно-динамическое моделирование, которое показало, как сигналы ионного тока соотносятся с аминокислотами в нанопоре.
Сканирование штрих-кода для идентификации
Новый метод очень эффективен для идентификации отдельных белков и картирования мельчайших изменений между ними - так же, как кассир в супермаркете идентифицирует каждый продукт, сканируя его штрих-код. Это также может обеспечить новый путь к полному секвенированию белков de novo в будущем. Генри Бринкерхофф поясняет: «Наш подход может заложить основу для однобелкового секвенатора в будущем, но секвенирование de novo остается большой проблемой. Для этого нам все еще нужно охарактеризовать сигналы от огромного количества пептидов, чтобы создать «карту», соединяющую сигналы ионного тока с белковой последовательностью. Тем не менее, способность различать замены одной аминокислоты в отдельных молекулах является большим достижением, и существует множество непосредственных применений этой технологии в ее нынешнем виде».
Взгляд на «темную материю» биологии
Используя текущий считыватель пептидов nanopore, исследователи могут начать анализировать, какие белки плавают в наших клетках. После синтеза в клетках белки все еще претерпевают изменения, влияющие на их функцию, называемые посттрансляционными модификациями. Получающиеся в результате миллионы белковых вариантов трудно измерить, и их можно считать «темной материей биологии». Сиз Деккер: «Продолжим метафору: после того, как ожерелье с бусинами будет сделано, оно все равно будет изменено: к некоторым красным бусинам присоединяется фосфорил, к некоторым синим бусинам - сахарная группа и т. д. Эти изменения имеют решающее значение для функционирования белка., а также маркер таких заболеваний, как рак. Мы думаем, что наш новый подход позволит нам обнаружить такие изменения и, таким образом, пролить свет на белки, которые мы носим с собой».