Ученые из EPFL разработали метод, который может изменить правила игры в генетике, делая определение ДНК-связывающих белков намного быстрее, точнее и эффективнее.
Гены содержат код ДНК для производства всех белков клетки. Чтобы начать этот процесс, гены должны быть сначала транскрибированы с ДНК на РНК. Для этого требуется огромное семейство ДНК-связывающих белков, называемых транскрипционными факторами, которые, учитывая их важность в экспрессии генов, представляют сегодня огромный интерес для биологов. Однако из-за их огромного количества, их способности объединяться в разные пары и технической сложности изучения их ДНК-связывающих свойств в лаборатории мы до сих пор очень мало знаем о многих факторах транскрипции, несмотря на обширные усилия. Теперь ученые EPFL разработали метод, основанный на микрофлюидике, который может значительно ускорить процесс с минимальным количеством необходимых материалов и который может быть распространен на другие молекулы и исследования, например. анализ взаимодействия белок-РНК. Опубликовав в журнале Nature Methods, исследователи уже использовали этот метод для определения свойств ДНК-связывания более 60 факторов транскрипции, включая девять новых.
Транскрипционные факторы
Млекопитающие, включая человека, имеют от 1300 до 2000 факторов транскрипции, многие из которых объединяются с другими в «гетеродимеры», чтобы связывать гены и вызывать их транскрипцию в РНК. Поскольку один фактор транскрипции может сочетаться с другими факторами в зависимости от типа клеток, в которых они активны, количество возможных комбинаций может быть очень большим.
Но недостаточно просто знать идентичность факторов транскрипции и то, какие из них образуют пары; нам также необходимо понять их ДНК-связывающие свойства, такие как их сродство и специфичность к ДНК, и это также включает гетеродимеры. Это ключевой момент, если мы собираемся когда-либо использовать факторы транскрипции в биотехнологических или фармацевтических целях в будущем. Но это также очень сложно сделать экспериментально, так как для этого требуется относительно большое количество труднодоступных факторов транскрипции.
Короче говоря, профилирование факторов транскрипции - пугающая и очень сложная задача. Существует несколько баз данных, в которых перечислены свойства связывания ДНК, но в целом они охватывают только около 500 отдельных факторов транскрипции и лишь часть гетеродимеров, число которых оценивается в диапазоне от 3000 до 25 000. Понятно, что прогресс в этой области идет медленно, и доступные профили в этих базах данных, как правило, имеют лишь посредственную количественную ценность с точки зрения предсказания генов-мишеней для этих факторов транскрипции.
Микрофлюидический подход
Лаборатория Барта Депланке в Институте биотехнологии EPFL изобрела новую технику под названием SMiLE-seq, которая может значительно ускорить процесс, используя лишь небольшое количество факторов транскрипции. В этом методе используется микрофлюидика, наука о контроле крошечных количеств жидкостей в столь же крошечных пространствах. Микрофлюидика быстро становится областью передового опыта в EPFL, объединяя ряд различных областей и дисциплин.
SMiLE-seq работает путем прикрепления небольшого количества фактора транскрипции (или факторов при зондировании гетеродимеров) в микрофлюидном устройстве - это чип с каналами микрометрового размера, которые позволяют жидкости протекать. Как только факторы транскрипции прикрепляются к поверхности чипа, большая библиотека случайных ДНК аккуратно закачивается в чип и течет по ним. Это позволяет факторам транскрипции распознавать соответствующие им последовательности ДНК. После этого комплекс транскрипционный фактор-ДНК физически улавливается путем опускания микрофлюидно управляемой кнопки, в то время как несвязанная ДНК просто смывается.
Далее связанная ДНК снимается с устройства и готовится к секвенированию, чтобы определить, какая ее часть попала под действие факторов транскрипции. Эта информация вводится в специализированное программное обеспечение, которое позволяет исследователям определять ДНК-связывающие свойства факторов транскрипции или гетеродимеров. В свою очередь, это помогает лучше прогнозировать их профили связывания ДНК in vivo.
Использование микрофлюидики в SMiLE-seq дает три основных преимущества: во-первых, оно сокращает количество факторов транскрипции, необходимых для этого типа эксперимента, поскольку для этого нужны только их пикограммы. Во-вторых, это значительно ускоряет процесс, с нескольких дней до менее чем часа. И, наконец, SMiLE-seq не ограничен ни длиной целевой последовательности ДНК, ни смещен в сторону более сильного аффинного взаимодействия белок-ДНК, как это может быть в современных методах..
Команда Депланке использовала SMiLE-seq для 67 полноразмерных факторов транскрипции человека, мыши и дрозофилы, успешно проанализировав некоторые из них, которые ранее никогда не изучались. В будущем он намерен использовать универсальность этого метода в других молекулах, таких как РНК. Его команда подала заявку на патент, и в настоящее время разрабатывается стартап, чтобы внедрить технологическую концепцию SMiLE-seq в коммерческий мир.