Общая аналогия с редактированием генов CRISPR заключается в том, что он работает как молекулярные ножницы, вырезая отдельные участки ДНК. Стэнли Ци, доценту кафедры биоинженерии Стэнфордского университета, нравится эта аналогия, но он считает, что пришло время переосмыслить CRISPR как швейцарский армейский нож.
«CRISPR может быть таким же простым, как резак, или более продвинутым, как регулятор, редактор, устройство для нанесения этикеток или изображений. В этой захватывающей области появляется множество приложений», - сказал Ци, который также является доцентом химическая и системная биология в Стэнфордской школе медицины и научный сотрудник Стэнфордского института CHEM-H.
Множество различных систем CRISPR, которые используются или проходят клинические испытания для генной терапии заболеваний глаз, печени и головного мозга, тем не менее, остаются ограниченными в своей области, потому что все они страдают одним и тем же недостатком: они слишком велики. и, следовательно, его слишком сложно доставить в клетки, ткани или живые организмы.
В статье, опубликованной 3 сентября в журнале Molecular Cell, Ци и его сотрудники объявляют о том, что, по их мнению, является важным шагом вперед для CRISPR: эффективной многоцелевой мини-системой CRISPR. В то время как обычно используемые системы CRISPR - с названиями вроде Cas9 и Cas12a, обозначающими различные версии CRISPR-ассоциированных (Cas) белков - состоят примерно из 1000-1500 аминокислот, их «CasMINI» состоит из 529.
Исследователи подтвердили в ходе экспериментов, что CasMINI может удалять, активировать и редактировать генетический код так же, как и его более мощные аналоги. Его меньший размер означает, что его должно быть легче доставить в клетки человека и организм человека, что делает его потенциальным инструментом для лечения различных заболеваний, включая заболевания глаз, дегенерацию органов и генетические заболевания в целом.
Настойчивые усилия
Чтобы сделать систему как можно меньше, исследователи решили начать с белка CRISPR Cas12f (также известного как Cas14), поскольку он содержит всего от 400 до 700 аминокислот. Однако, как и другие белки CRISPR, Cas12f естественным образом происходит от архей - одноклеточных организмов - что означает, что он не подходит для клеток млекопитающих, не говоря уже о клетках или телах человека. Известно, что только несколько белков CRISPR работают в клетках млекопитающих без модификации. К сожалению, CAS12f не входит в их число. Это делает его заманчивым вызовом для таких биоинженеров, как Ци.
«Мы подумали: «Хорошо, миллионы лет эволюции не смогли превратить эту систему CRISPR во что-то, что функционирует в человеческом теле. Можем ли мы изменить это всего за один или два года?», - сказал Ци.. «Насколько мне известно, мы впервые превратили неработающий CRISPR в работающий».
Действительно, Сяошу Сюй, научный сотрудник лаборатории Qi и ведущий автор статьи, не обнаружил активности природного Cas12f в клетках человека. Сюй и Ци предположили, что проблема заключалась в том, что ДНК генома человека сложнее и менее доступна, чем ДНК микробов, из-за чего Cas12f трудно найти свою цель в клетках. Глядя на предсказанную компьютером структуру системы Cas12f, она тщательно выбрала около 40 мутаций в белке, которые потенциально могли бы обойти это ограничение, и создала конвейер для одновременного тестирования множества вариантов белка. Теоретически рабочий вариант может сделать человеческую клетку зеленой за счет активации зеленого флуоресцентного белка (GFP) в ее геноме.
«Сначала эта система вообще не работала в течение года», - сказал Сюй. «Но после итераций биоинженерии мы увидели, как некоторые сконструированные белки начали включаться, как по волшебству. Это заставило нас по-настоящему оценить мощь синтетической биологии и биоинженерии».
Первые успешные результаты были скромными, но они взволновали Сюй и побудили ее двигаться вперед, потому что это означало, что система работала. В ходе многих дополнительных итераций ей удалось еще больше улучшить характеристики белка.«Мы начали с того, что увидели только две клетки с зеленым сигналом, а теперь, после разработки, почти каждая клетка под микроскопом зеленая», - сказал Сюй.
«В какой-то момент мне пришлось ее остановить», - вспоминает Ци. «Я сказал: «На данный момент это хорошо. Вы сделали довольно хорошую систему. Мы должны подумать о том, как эту молекулу можно использовать для приложений».
В дополнение к белковой инженерии исследователи также разработали РНК, которая направляет белок Cas к ДНК-мишени. Модификации обоих компонентов имели решающее значение для того, чтобы система CasMINI работала в клетках человека. Они проверили способность CasMINI удалять и редактировать гены в лабораторных клетках человека, включая гены, связанные с ВИЧ-инфекцией, противоопухолевым иммунным ответом и анемией. Это сработало почти для каждого гена, который они тестировали, с надежными ответами в нескольких.
Открывая дверь
Исследователи уже начали налаживать сотрудничество с другими учеными для проведения генной терапии. Они также заинтересованы в том, как они могут внести свой вклад в развитие технологий РНК - например, что было использовано для разработки мРНК вакцин против COVID-19 - где размер также может быть ограничивающим фактором.
«Эта способность проектировать эти системы была востребована в полевых условиях с первых дней существования CRISPR, и я чувствую, что мы внесли свой вклад в движение к этой реальности», - сказал Ци. «И этот инженерный подход может быть очень полезным. Вот что меня волнует - открывать двери для новых возможностей».