Представьте, что вы стоите на лесопилке, и вас просят построить дом без каких-либо чертежей или инструкций. Все материалы перед вами, но это не значит, что у вас есть первая идея, как добраться из пункта А в пункт Б.
В такой ситуации столкнулись биологи из Принстона, которые строят микротрубочки, скелет клетки, с нуля.
«Мы не думали, что это возможно», - сказала Сабина Петри, доцент кафедры молекулярной биологии. В течение многих лет Петри и исследователи из ее лаборатории ослепляли биологический мир видеороликами того, что они называют «фейерверком жизни», которые показывают разветвление и рост этих микроскопических структур. «От изготовления фейерверков до получения рецепта их изготовления? Мы представляли и обсуждали это в течение пяти лет». За это время ее команда тщательно определила компоненты фейерверка, по одному белку за раз, а аспирантка Аканкша Тавани придумала модель последовательности, но проверить ее казалось невозможным..
Но потом рецензенты журнала сказали им, что они не могут публиковать свою модель, пока не подтвердят ее экспериментально.
«По общему признанию, после того, как Аканкша так долго работал над этим, когда рефери попросил еще работы, я скептически отнесся к тому, что мы сможем разобраться в порядке молекулярных соединений в любое разумное время», - сказал Говард Стоун, Дональд из Принстона. Р. Диксон '69 и Элизабет В. Диксон, профессор машиностроения и аэрокосмической техники и соконсультант Тавани. «Но Аканкша была сосредоточена и дисциплинирована, и систематически проводила эксперименты, которые определяли порядок молекулярных связей. Следить за ее детективной работой было ошеломляюще».
«Они попросили нас, и мы хотели опубликовать это, так что это помогло», - сказал Петри. «Процесс рецензирования вызывает много негативных отзывов в прессе, но рецензенты иногда могут вывести вас на новый уровень». Результаты их работы опубликованы в журнале eLife.
Строим дом без чертежей
Микротрубочки - это кирпичи и известковый раствор клетки, используемые для построения клеточных стенок и веретен митоза и мейоза - без них даже одноклеточные организмы не могли бы воспроизводиться - но до сих пор никто точно не знал, как микротрубочки ответвляются друг от друга. В течение десятилетия исследователи знали, что ветвление, вызванное ростом микротрубочек друг от друга, является ключом к сборке веретен и установлению связей между клеточными компонентами.
«Недостающим элементом в течение десятилетия или около того было это разветвление микротрубочек - то, что микротрубочки не растут просто линейно, они действительно разветвляются, и они могут разветвляться снова и снова, создавая этот фейерверк», - сказал Петри.
Несмотря на то, что команда Петри определила компоненты, необходимые для построения микротрубочек, они не составили последовательность - рецепт, - который разъяснял бы, как именно их собрать на молекулярном уровне, чтобы заставить веретена расти и разветвляться. в фейерверк. И по большей части это было нормально. Биология сделала это за них. Если бы они собрали правильные компоненты, фейерверк только увеличился бы.
Но как именно это произошло? Этот вопрос не давал покоя Тавани, аспирантке химического и биологического факультета, проводившей свои исследования в лаборатории Петри.
«Долгое время я смотрел на них и задавался вопросом, как это работает с нуля», - сказал Тавани, который недавно выиграл стипендию Шарлотты Элизабет Проктор для аспирантов на последнем курсе.«Мы начинаем вообще без микротрубочек, а затем, в течение 15 минут, у нас есть эти прекрасные структуры. Как вы создаете структуру из этих белков нанометрового размера? Что такого было в их кинетике связывания или их организации, что привело к структуры, которые мы видим?"
Тавани обладал уникальными возможностями для решения этих вопросов, потратив годы на изучение химического машиностроения и физики, а также молекулярной биологии. По сути, она изобрела новую специальность между тремя областями. «На пересечении дисциплин - вот где следующая, лучшая наука», - сказала она.
Доклад eLife стоит на этом необычном перекрестке: из четырех авторов все, кроме Тавани, являются главными исследователями (PI) своих собственных исследовательских лабораторий в трех обычно не связанных между собой областях: Петри в биологии; Камень в технике; и Джошуа Шаевиц, профессор физики из Института интегративной геномики Льюиса-Сиглера.
«Я не знаю многих примеров, когда сначала был один автор, а затем три PI», - сказал Петри. «Я думаю, что это сильная сторона Принстона. Я не знаю другого места, где было бы так легко собрать вместе трех профессоров для реализации проекта».
Ключом, как понял Тавани, было создание компьютерной модели, основанной на точных измерениях моделей роста микротрубочек. Для этого потребовалось визуализировать фейерверк с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), сильная сторона лаборатории Петри, которая разработала методы оптической изоляции области образца толщиной 100 нанометров, чтобы можно было увидеть ветвящиеся микротрубочки в море фона. молекулы. (Для справки, человеческий волос примерно в 500 раз шире.)
Но даже тогда каждый пиксель, зафиксированный камерой, содержал тысячи молекул. Тавани пришлось найти способ дезагрегировать визуальные данные, чтобы провести наблюдения за отдельными молекулами, что потребовало месяцев сложного анализа изображений и помощи Шаевица, который потратил годы на анализ изображений.
В конечном счете, Тавани точно измерил, когда и где отдельный белок связывается с существующей микротрубочкой, чтобы начать новую ветвь, а также скорость его роста, рассматривая каждую молекулу за раз.
«Традиционный подход, при котором вы меняете количество различных молекул в реакции ветвления, не позволяет вам выяснить порядок, в котором должны происходить вещи», - сказал Шаевиц, который также является содиректором. Центра физики биологических функций, финансируемого NSF. «Глядя на отдельные молекулы, мы можем буквально наблюдать за их сборкой по частям».
Thawani затем создал компьютерную модель, используя эти параметры. Другие ученые пытались смоделировать ветвление микротрубочек и раньше, но ни у кого не было доступа к таким точным измерениям, чтобы проверить результаты своей модели. Затем она проверила различные последовательности, которые исследователи обдумывали годами, и модель исключила все, кроме одной.
Итак, теперь у исследовательской группы были ингредиенты - белки, называемые TPX2, аугмин и?-TuRC, - а также последовательность шагов, но компьютер не мог сказать им, какой белок и когда добавлять. И, как знает любой, кто собирал мебель или выпекал хлеб с нуля, делать шаги не по порядку просто не получится.
Последний поворот
Эксперименты, запрошенные рецензентами, показали, что ожидания Тавани и Петри не оправдались. «Мы думали, что сначала это должен быть аугмин, а затем TPX2, но оказалось наоборот», - сказал Тавани. «Это был поворот».
Благодаря этому открытию у исследователей появился полный рецепт для создания фейерверка из микротрубочек: если TPX2 отложить на существующих микротрубочках, а затем связать аугмин с?-TuRC, тогда новые микротрубочки зародятся и разветвятся.
В качестве последнего шага они подтвердили, что белки будут связываться точно с той скоростью, которую предсказывает компьютерная модель Тавани.«Это был третий прорыв, - сказал Петри, - когда эти числа совпали, что то, что было предсказано ее моделью на компьютере, было верно для биологии».
«Эта работа Петри является действительно важным дополнением, которое поможет продвинуть эту область вперед», - сказал Дэниел Нидлман, профессор прикладной физики Гордона Маккея и профессор молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета. «Я думаю, что эта работа в сочетании с результатами моей группы и Яна Брюгеса (из Института молекулярно-клеточной биологии и генетики им. Макса Планка в Дрездене) действительно прояснила «правила» зарождения микротрубочек в веретенах. Следующий шаг будет выяснить молекулярные процессы, которые управляют этими правилами. Петри и колледжи установили систему, которая действительно должна помочь в этом».
Оглядываясь назад, Петри сказал, что работа была «полной сюрпризов, как экспериментальных, так и в отношении того, чего можно достичь и как этого можно достичь. Возвращаясь к этому давнему вопросу с участием профессоров из трех областей, процесс обзора - вся система работала."